鉴别HP-PRRSV和NADC30-like毒株的检测引物和探针、试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术提供一种鉴别HP‑PRRSV和NADC30‑like毒株的检测引物和探针、试剂盒及应用，所述检测引物如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，所述探针如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示。本发明专利技术进一步公开了一种用于鉴别HP‑PRRSV毒株和NADC30‑like毒株的试剂盒，利用鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒HP‑PRRSV毒株和NADC30‑like毒株两种毒株。本发明专利技术引物及方法特异、快速、敏感，能够应用于猪繁殖与呼吸综合征病毒HP‑PRRSV和NADC30‑like两种毒株的鉴别检测。

Detection primers, probes, kits and applications for identifying HP-PRRSV and NADC30-like strains

The invention provides a detection primer and probe, a kit and an application for identifying HP PRRSV and NADC30 like strains. The detection primers are shown as SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.4 and SEQ ID NO.5, and the probes are shown as SEQ ID NO.3 and SEQ ID NO.6. The invention further discloses a kit for identifying HP PRRSV strain and NADC30 like strain, using two strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus HP PRRSV PRRSV strain and NADC30 like virus strain. The primers and methods of the invention are specific, fast and sensitive, and can be applied to the identification and identification of two strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus HP, PRRSV and NADC30 like.

【技术实现步骤摘要】
鉴别HP-PRRSV和NADC30-like毒株的检测引物和探针、试剂盒及应用
本专利技术具体涉及一种用于鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒HP-PRRSV毒株和NADC30-like毒株的检测引物和探针、试剂盒及应用，属于猪繁殖与呼吸综合征病毒不同毒株的检测鉴别领域。
技术介绍
2006年6月开始，我国南方部分省市猪群中发生了以体温高热不退、皮肤发红、呼吸困难为主要临床症状的疫情，并迅速传遍全国，给我国养猪业造成了巨大经济损失。经流行病学调查、病毒分离、基因分析、动物试验等，最终确定是由PRRSV变异株造成的，并定名为高致病性PRRSV(HP-PRRSV)。之后，HP-PRRSV长期在我国流行，并持续给我国养猪业造成了不可估量的损失。2014年底开始，起源于美国的PRRSV缺失株NADC30-like毒株在我国东部省份被鉴定到，并引发母猪严重的流产或早产，又一次严重打击了给我国养猪业。至此，我国临床猪场中PRRSV的流行以HP-PRRSV和NADC30-like两种毒株共同流行为主。国内对于临床猪场中PRRSV的检测方法主要有Marc-145细胞传代检测法、酶联免疫吸附试验、RT-PCR技术、荧光抗体检测法、微量血清中和试验等。常规的检测方法存在费时费力、灵敏度低等缺点，而且大部分检测方法不能有效地鉴别HP-PRRSV和NADC30-like毒株，RT-PCR技术虽然能鉴别HP-PRRSV和NADC30-like毒株，但荧光定量RT-PCR检测方法的出现，比普通RT-PCR方法的灵敏性更强、特异性更好、污染几率小，高通量等优势。而且Taqman探针法荧光定量RT-PCR技术检测出现的假阳性低、结果准确可靠，适用于临床猪群中HP-PRRSV和NADC30-like毒株的鉴别检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供用于一种鉴别HP-PRRSV和NADC30-like毒株的检测引物和探针。本专利技术的另一个目的是提供HP-PRRSV和NADC30-like毒株的检测试剂盒及检测方法。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案是：一种用于HP-PRRSV和NADC30-like毒株的检测引物和探针，包括用于检测HP-PRRSV毒株的检测引物和探针以及用于检测NADC30-like毒株的检测引物和探针，其中：用于检测HP-PRRSV毒株的检测引物和探针：nsp2-HV-F:5′-CACCTTCCGTGAGTGCAGAG-3′(SEQIDNO.1)；nsp2-HV-R:5′-AATCAGTGAATGAGCCGACA-3′(SEQIDNO.2)；nsp2-HV-P:5′-FAM-GAGACACTGACGAGCTGCTTG-BHQ1-3′(SEQIDNO.3)。用于检测NADC30-like毒株的检测引物和探针：nsp2-del-F:5′-CGAATGARCCTGTGCCTGTCCC-3′(SEQIDNO.4)；nsp2-del-R:5′-TTCCTTCCACCTGCTGAAGCCCAC-3′(SEQIDNO.5)；nsp2-del-P:5′-HEX-CCCTGTGCCCGCACCACGA-BHQ2-3′(SEQIDNO.6)；其中，R为A，G。进一步的，本专利技术还提供含有所述引物和探针的用于HP-PRRSV和NADC30-like毒株的荧光定量RT-PCR检测试剂盒。进一步的，所述试剂盒还包括以下组分：2×RT-PCRBuffer缓冲液、DNA聚合酶、反转录酶、上游引物、下游引物、探针、TotalRNA、RNasefreeH2O。作为最优方案，所述RT-PCR反应液的总体积为25μL，所述RT-PCR反应液包括以下组分：2×OneStepRT-PCRBufferⅢ：12.5μL(购于TaKaRa公司)，PrimeScriptRTEnzymeMixⅡ：0.5μL(购于TaKaRa公司)，5U/μLTaKaRaExTaqHS：0.5μL(购于TaKaRa公司)，nsp2-HV-F(20μM)：0.6μL，nsp2-HV-R(20μM)：0.6μL，nsp2-HV-P(20μM)：0.4μL，nsp2-del-F(20μM)：0.6μL，nsp2-del-R(20μM)：0.6μL，nsp2-del-P(20μM)：0.4μL，TotalRNA：5μL，RNasefreeH2O：3.3μL。进一步的，所述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照。所述HP-PRRSV和NADC30-like毒株的荧光定量RT-PCR检测试剂盒使用时包括如下步骤：S1.提取待检样品的RNA；S2.一步法RT-PCR，利用反转录过程将RNA反转录成cDNA，同时进行荧光定量PCR；S3.对数据进行处理、判定检测结果；本专利技术所述的RNA提取是指用商品化病毒RNA试剂盒提取的RNA或用Trizol法提取的病毒RNA。本专利技术中最优反应程序是指1个循环反转录50℃，30min；1个循环cDNA预变性95℃，1min；40个循环95℃，15sec；60℃，30sec，于60℃进行荧光信号采集。本专利技术所述的结果判定：点击荧光定量PCR仪分析界面，取3～15个循环荧光信号为基线。阈值为阈值线刚好超过正常阴性对照的扩增曲线的最高点，无Ct值并且与阳性对照的指数期相交为准。当检测样本的Ct值≤35，且曲线有明显的指数增长期，结果可以直接判定为阳性；当检测样品35<Ct值<40，需要重新检测一次，若Ct值仍<40，且扩增曲线有明显的指数增长期，可判定结果为阳性，否则为阴性；检测结果无Ct值或Ct值为40，结果判定为阴性。用于鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒HP-PRRSV毒株和NADC30-like毒株的荧光定量RT-PCR检测引物、探针及试剂盒，包括应用荧光定量RT-PCR方法检测待测样本中是否存在HP-PRRSV毒株和NADC30-like毒株RNA的步骤，其中所述RT-PCR方法应用了以下引物对和探针：序列为：nsp2-HV-F:5′-CACCTTCCGTGAGTGCAGAG-3′，nsp2-HV-R:5′-AATCAGTGAATGAGCCGACA-3′，nsp2-HV-P:5′-FAM-GAGACACTGACGAGCTGCTTG-BHQ1-3′，nsp2-del-F:5′-CGAATGARCCTGTGCCTGTCCC-3′，nsp2-del-R:5′-TTCCTTCCACCTGCTGAAGCCCAC-3′，nsp2-del-P:5′-HEX-CCCTGTGCCCGCACCACGA-BHQ2-3′。用于鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒HP-PRRSV毒株和NADC30-like毒株的荧光定量RT-PCR检测引物、探针及试剂盒，还包括应用上述荧光定量RT-PCR试剂盒检测待测样本中是否存在HP-PRRSV毒株和NADC30-like毒株RNA的步骤。与现有技术相比，本专利技术具有的优点和积极效果是：本专利技术根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒HP-PRRSV毒株和NADC30-like毒株的基因序列设计了两对特异性引物，通过对荧光定量RT-PCR反应条件进行相应的优化，具有较好的重复性、灵敏性和特异性，可以分别用于猪繁殖与呼吸综合征病毒HP-PRRSV毒株和NADC30-li本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.鉴别HP‑PRRSV和NADC30‑like毒株的检测引物和探针，其特征在于，包括用于检测HP‑PRRSV毒株的检测引物和探针以及用于检测NADC30‑like毒株的检测引物和探针；其中：用于检测HP‑PRRSV毒株的检测引物和探针：nsp2‑HV‑F:5′‑CACCTTCCGTGAGTGCAGAG‑3′(SEQ ID NO.1)；nsp2‑HV‑R:5′‑AATCAGTGAATGAGCCGACA‑3′(SEQ ID NO.2)；nsp2‑HV‑P:5′‑FAM‑GAGACACTGACGAGCTGCTTG‑BHQ1‑3′(SEQ ID NO.3)；用于检测NADC30‑like毒株的检测引物和探针：nsp2‑del‑F:5′‑CGAATGARCCTGTGCCTGTCCC‑3′(SEQ ID NO.4)；nsp2‑del‑R:5′‑TTCCTTCCACCTGCTGAAGCCCAC‑3′(SEQ ID NO.5)；nsp2‑del‑P:5′‑HEX‑CCCTGTGCCCGCACCACGA‑BHQ2‑3′(SEQ ID NO.6)；其中，R为A，G。

【技术特征摘要】
1.鉴别HP-PRRSV和NADC30-like毒株的检测引物和探针，其特征在于，包括用于检测HP-PRRSV毒株的检测引物和探针以及用于检测NADC30-like毒株的检测引物和探针；其中：用于检测HP-PRRSV毒株的检测引物和探针：nsp2-HV-F:5′-CACCTTCCGTGAGTGCAGAG-3′(SEQIDNO.1)；nsp2-HV-R:5′-AATCAGTGAATGAGCCGACA-3′(SEQIDNO.2)；nsp2-HV-P:5′-FAM-GAGACACTGACGAGCTGCTTG-BHQ1-3′(SEQIDNO.3)；用于检测NADC30-like毒株的检测引物和探针：nsp2-del-F:5′-CGAATGARCCTGTGCCTGTCCC-3′(SEQIDNO.4)；nsp2-del-R:5′-TTCCTTCCACCTGCTGAAGCCCAC-3′(SEQIDNO.5)；nsp2-del-P:5′-HEX-CCCTGTGCCCGCACCACGA-BHQ2-3′(SEQIDNO.6)；其中，R为A，G。2.用于鉴别HP-PRRSV毒株和NADC30-like毒株的试剂盒，其特征在于，其包含权利要求1所述的检测引物和探针。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含用于25μL荧光定量RT-PCR反应体系的试剂：荧光定量一部分RT-PCR反应液2×OneStepRT-PCRBufferⅢ12.5μL，PrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.5μL，TaKaRaExTaqHS0.5μL，nsp2-HV-F(20μM)0.6μL，nsp2-HV-R(20μM)0.6μL，nsp2-HV-P(20μM)0.4μL，nsp2-del-F(20μM)0.6μL，nsp2-del-R(20μM)0.6μL，nsp2-del-P(20μM)0.4μL，TotalRNA5μL，RNasefreeH2O3.3μL。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括阳性对照标准品和阴性对照标准品。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照标准品为重组质粒pMD18-T-nsp2...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋涛，芮萍，马增军，严世杰，郝建香，
申请(专利权)人：河北科技师范学院，
类型：发明
国别省市：河北,13