一种通用型猪蓝耳病毒三重巢式RT-PCR检测引物及方法技术

本发明专利技术提供了一种用于检测猪蓝耳病毒的三重巢氏RT‑PCR引物及检测方法。所述巢式RT‑PCR引物是通过编码猪蓝耳病毒NSP2基因中碱基序列得到两对带有简并碱基的引物。所述检测方法为：提取待测样品的RNA，用两对引物进行两次PCR扩增，每次扩增产物分别进行电泳检测，依据目的基因片段大小来区分猪经典毒株、高致病性变异毒株和NADC‑30毒株。本发明专利技术提供的巢式RT‑PCR检测方法简便可靠、特异性强、灵敏度高、抗干扰性能好，克服了普通RT‑PCR检测灵敏度低，特异性差，需分别检测蓝耳病的经典毒株、高致病性变异株及NADC‑30等问题，而且成本低，检测周期短，具有良好的应用前景。

A three fold nested RT-PCR detection primer and method for universal swine ear virus

The invention provides a three fold nest RT PCR primer and a detection method for detecting porcine blue ear virus. The nested RT PCR primer was used to generate two pairs of primers with degenerate bases by encoding the nucleotide sequence of NSP2 gene of porcine blue ear virus. The detection method is as follows: extracting the RNA of the sample to be tested, and using two pairs of primers for two PCR amplification, each amplification product is electrophoretic detection separately, and according to the size of the target gene fragment to distinguish the classical swine virus, the highly pathogenic variant strain and the NADC strain 30 strain. The nested RT_ PCR detection method provided by the invention is simple and reliable, has strong specificity, high sensitivity and good anti-interference performance, overcomes the problems of low sensitivity and poor specificity of ordinary RT_ PCR detection, and needs to detect classical strains of blue ear disease, highly pathogenic variants and NADC_ 30 separately, and has low cost, short detection cycle, and good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种通用型猪蓝耳病毒三重巢式RT-PCR检测引物及方法
本专利技术涉及分子诊断
，特别涉及一种通用型猪蓝耳病毒三重巢式RT-PCR检测引物及方法。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)又称为猪蓝耳病毒，以引起母猪流产，产死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔猪和育肥猪呼吸困难、败血症、高死亡率为主要特征。该病在世界各地普遍存在，给我国的养猪业造成严重的经济损失。猪蓝耳病毒为套式病毒目(Nidovirales)、动脉炎病毒科(Arteriviridac)、动脉炎病毒属(Arterivirirus)，基因组为单股正链RNA病毒，不分节段RNA，含有5'端非编码区、10个开放阅读框架(ORF1a、ORF2a、ORF1b、ORF2b、ORF3-7、ORF5a)编码病毒结构蛋白(GP2、GP3、GP4、GP5、M、N)和3'端UTR,组长约15kb。目前国际上根据PRRSV的抗原特性，可将其分为欧洲型和美洲型2个血清型，美洲型毒株又根据其在非结构蛋白NSP2碱基数的缺失分为三种亚型，分别为经典毒株、高致病性变异毒株和NADC-30毒株。近年来，PRRSV基因组的变异现象引起了人们的关注，也是造成本病难以控制的重要原因之一。目前猪蓝耳病毒的检测方法主要是实验室检测。病原学检测技术主要有普通RT-PCR、荧光定量RT-PCR等。血清学检测方法中主要是抗体检测。但采用单一对引物分别用PCR扩增单独三种亚型具有敏感性较低、操作繁琐、检测时间长等缺点，不能及时了解检测样本PRRS的基因特点。本专利技术在单一常规的RT-PCR基础上建立一种巢式RT-PCR方法，通过两对引物扩增出不同的目的片段来区分猪经典毒株、高致病性变异毒株和NADC-30毒株，以提高检测的敏感性及特异性。巢式RT-PCR是一种变异的聚合酶链反应，使用两对PCR引物扩增目的片段。经过两次PCR扩增，可以极大程度的提高普通PCR的灵敏度，且二次PCR引物发生非特异性结合的概率极低。根据密码子的兼并性,常用一个符号代替某两个或者更多碱基，改符号即为简并碱基。并专利中设计引物中R和Y即简并碱基，从而可以扩增出经典毒株、高致病性变异毒株和NADC-30的不同条带。且只有一条是真正可以和模板配对的。序列分析显示：流行毒株NSP2蛋白氨基酸高度保守，可以作为临床诊断的靶抗原。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的是在于提供一种快速简便的猪蓝耳病巢式RT-PCR检测方法，不仅可快速区分猪感染蓝耳病的不同病毒亚型，同时具有特异性强、灵敏度高等特点。本专利技术是通过以下技术方案实现的：猪蓝耳病毒的巢式RT-PCR引物的设计：通过编码猪蓝耳病毒NSP2基因中碱基序列得到两对带有简并碱基的巢式检测引物，所述两对检测引物，分别为外侧引物PRRSV-O-F、PRRSV-O-R和内侧引物PRRSV-I-F、PRRSV-I-R，序列如下：PRRSV-O-F：AATCTTGARGAATGCTTGGC(SEQIDNO.1)；PRRSV-O-R：GCTGAGTAYTTTGGGCGTG(SEQIDNO.2)；PRRSV-I-F：TTCTTTGATTGGRATGTTGTGC(SEQIDNO.3)；PRRSV-I-R：CAAGGAGCTGCTTGAYGACAC(SEQIDNO.4)；其中，简并碱基R表示A或G，简并碱基Y表示C或T。猪蓝耳病毒三重巢式RT-PCR检测方法的建立，包括以下步骤：S1、提取待测样品的RNA；S2、第一轮扩增：以S1提取的RNA为模板，利用外侧引物进行第一轮扩增，PCR反应体系为：2×1StepBuffer12.5μl，PrimeScript1StepEnzymeMix1μl，20μmol/L的PRRSV-O-F与20μmol/L的PRRSV-O-R各1μl，RNA模板0.5μl，补加RNaseFreedH2O至25μl；PCR反应程序为：50℃反转录30min，94℃预变性2min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸8min，PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，若无目的条带则进行第二次扩增；S3、第二轮扩增：以S2扩增产物稀释50倍为模板，利用内侧引物进行第二轮扩增，PCR反应体系为：Mix12.5μl，20μmol/L的PRRSV-I-F与20μmol/L的PRRSV-I-R各1μl，模板1μl，补加RNaseFreedH2O至25μl；PCR反应程序为：94℃预变性2min，98℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环，72℃延伸8min，PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，根据检测结果进行判断。进一步地，S1所述待检测RNA从猪的初乳、精液、血清、组织(包括胎盘)或恶露等样品中提取。进一步地，S2所述目的条带为1124bp，1034bp或731bp。更进一步地，目的条带为1124bp，判定样品中含有猪经典蓝耳病毒；目的条带为1034bp，判定样品中含有猪高致病性蓝耳病毒；目的条带为731bp，判定样品中含有猪类NADC-30蓝耳病毒。进一步地，S3所述结果判断具体为：目的条带为1029bp，判定样品中含有猪经典蓝耳病毒；目的条带为939bp，判定样品中含有猪高致病性蓝耳病毒；目的条带为636bp，判定样品中含有猪类NADC-30蓝耳病毒。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术提供了两对带有简并碱基的引物，可一次性检测出所测样品中感染猪蓝耳病毒是经典毒株或高致病性变异毒株或NADC-30，解决了对蓝耳病三种毒株分别检测所带来的耗时、耗材、灵敏性低等缺点。(2)本专利技术提供的巢式RT-PCR检测引物，是通过编码高度保守的NSP2蛋白基因的碱基序列设计出的4条特异性引物，具有较强的特异性。(3)本专利技术提供的RT-PCR检测方法，通过多步扩增检测，适用范围宽，最低检测限比普通PCR检测方法灵敏度高2-3个数量级。(4)该检测方法能从混合模板中扩增出特异性条带，干扰性较好，可靠性强；而且还适用于猪的初乳或精液，恶露等样本的检测，具有较强的实用性，利于推广和普及。附图说明图1为巢式RT-PCR外侧引物特异性检测的凝胶电泳图，其中M为DL2000DNAMarker；1为重组阳性质粒；2为经典蓝耳病毒质粒；3为高致病性蓝耳病毒质粒；4为NADC-30病毒质粒；5-8分别为猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌；9为阴性对照(RNase-freewater)。图2为巢式RT-PCR内侧引物特异性检测的凝胶电泳图，M为DL2000DNAMarker；1为重组阳性质粒；2为经典蓝耳病毒质粒；3为高致病性蓝耳病毒质粒；4为NADC-30病毒质粒；5-8分别为猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌；9为阴性对照(RNase-freewater)。图3为巢式RT-PCR外侧引物敏感性检测的凝胶电泳图，M为DL2000DNAMarker；1-8中PRRSV经典毒株模板拷贝数依次为3.8×107，3.8×106，3.8×105，3.8×104，3.8×103，3.8×102，3.8×101，3.8；1-8中P本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪蓝耳病毒三重巢式RT‑PCR特异性引物，其特征在于：所述引物根据检测猪蓝耳病病毒NSP2基因中碱基序列得到两对带有简并碱基的引物，所述两对引物，分别为外侧引物PRRSV‑O‑F、PRRSV‑O‑R和内侧引物PRRSV‑I‑F、PRRSV‑I‑R，具体为：PRRSV‑O‑F：AATCTTGARGAATGCTTGGC(SEQ ID NO.1)；PRRSV‑O‑R：GCTGAGTAYTTTGGGCGTG(SEQ ID NO.2)；PRRSV‑I‑F：TTCTTTGATTGGRATGTTGTGC(SEQ ID NO.3)；PRRSV‑I‑R：CAAGGAGCTGCTTGAYGACAC(SEQ ID NO.4)；其中，简并碱基R表示A或G，简并碱基Y表示C或T。

【技术特征摘要】
1.一种猪蓝耳病毒三重巢式RT-PCR特异性引物，其特征在于：所述引物根据检测猪蓝耳病病毒NSP2基因中碱基序列得到两对带有简并碱基的引物，所述两对引物，分别为外侧引物PRRSV-O-F、PRRSV-O-R和内侧引物PRRSV-I-F、PRRSV-I-R，具体为：PRRSV-O-F：AATCTTGARGAATGCTTGGC(SEQIDNO.1)；PRRSV-O-R：GCTGAGTAYTTTGGGCGTG(SEQIDNO.2)；PRRSV-I-F：TTCTTTGATTGGRATGTTGTGC(SEQIDNO.3)；PRRSV-I-R：CAAGGAGCTGCTTGAYGACAC(SEQIDNO.4)；其中，简并碱基R表示A或G，简并碱基Y表示C或T。2.一种猪蓝耳病毒三重巢式RT-PCR检测方法，其特征在于：包含以下步骤：S1、提取待测样品的RNA；S2、以S1提取的RNA为模板，利用PRRSV-O-F和PRRSV-O-R进行第一轮PCR扩增，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，若无目的条带则进行第二次扩增；S3、以S2扩增产物为模板，利用PRRSV-I-F和PRRSV-I-R进行第二轮PCR扩增，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，依据目的条带来区分毒株类型。3.根据权利要求2所述的一种猪蓝耳病毒三重巢式RT-PCR检测方法，其特征在于，S2所述PCR反应体系为：2×1StepBuffer12.5μl，PrimeScript1StepEnzymeMix1μl，20μmol/L的PRRSV-O-F与20μmol/L的PRRSV-O-R各1μl，RNA模板0.5μl，补加RNaseFreedH2O至25μl；PCR反应程序为：50℃反转录30min，94℃预变性2min，94℃变性30s...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘国平，晋钱钱，谢洪涛，常小云，胡利群，
申请(专利权)人：长江大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42