一种通用型猪圆环病毒3型巢氏PCR检测引物及方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测猪圆环病毒3型巢氏PCR检测引物及方法，所述巢式PCR引物是通过编码猪圆环病毒3型Cap蛋白ORF2基因部分更保守的碱基序列，设计两对巢式检测引物。所述检测方法为：提取待测样品DNA，将所述样本DNA用两对检测引物进行两轮PCR扩增，每轮PCR扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳以检测圆环病毒3型ORF2基因的特异性片段。该方法克服了普通PCR检测灵敏度低，特异性差等问题，而且成本较低，检测周期短，具有良好的应用前景。

A universal primer and method for detecting nested PCR of porcine circovirus type 3

The invention discloses a detection primer and a method for detecting the nested PCR of porcine circovirus type 3. The nested PCR primer is designed by two parts of a nested detection primer, which is designed to contain a more conservative base sequence of the Cap gene ORF2 gene of porcine circovirus type 3. The detection method is as follows: extracting the sample DNA to be tested, and amplifying the sample DNA with two pairs of detection primers for two rounds of PCR amplification. Each round of PCR amplified products is agarose gel electrophoresis respectively to detect the specific fragment of the ORF2 gene of the circovirus type 3. This method overcomes the problems of low sensitivity and specificity of ordinary PCR detection, and has low cost and short detection cycle. It has good application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种通用型猪圆环病毒3型巢氏PCR检测引物及方法
本专利技术属于分子诊断
，具体涉及一种通用型猪圆环病毒3型巢氏PCR检测引物及方法。技术背景圆环病毒(PCV)属圆环病毒科圆环病毒属，该病毒为单股环状DNA病毒，无囊膜，其粒子直径为14-17nm，基因组大小约为1.76kd。PCV根据血清型分为PCV1,PCV2和PCV3。其中，PCV1在猪群中广泛存在，但无致病性。PCV2主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征。2016年，美国堪萨斯州立大学科研人员利用宏基因组测序技术，从患有皮炎肾病综合征(PDNS)和繁殖障碍母猪及其流产胎儿体内首次鉴定出一种新型猪圆环病毒，命名为猪圆环病毒3型(Porcinecircovirus3，PCV3)。PCV3于2016年首次在美国报道，与母猪丘疹性皮炎、肾病综合征和流产相关。PCV3基因组2000bp，与PCV1/2同源性低于40％，遗传进化分析位于不同的分支。PCV3基因组包括3个开放阅读框：其中ORF1编码Rep蛋白；ORF2编码Cap蛋白；ORF3编码一个231个氨基酸的蛋白，功能未知。华南农业大学何启盖教授课题组首次在中国检测到PCV3China/GD2016株，该毒株与美国PCV3毒株同源性为97.4％-98.5％。PCV3基因组和衣壳蛋白核苷酸序列在中国毒株之间相似性分别为99.0％-100％和98.4-100％；PCV3基因组和衣壳蛋白核苷酸序列与美国毒株的相似性分别为99.0％-99.1％和98.4％-98.9％。进一步的调查研究表明我国的新型PCV3毒株和蝙蝠圆环病毒毒株BtMr-CV/GD2012(KJ641711.1)存在重组现象，表明新型猪PCV3毒株和蝙蝠PCV毒株之间存在遗传进化关联性。PCV3感染可导致母猪出现厌食症状，皮肤出现多灶性丘疹、斑点和浅表性皮炎，生产性能下降；妊娠母猪发生繁殖障碍，产弱胎、死胎、木乃伊胎和弱仔猪，病情严重甚至造成急性死亡；不同胎龄胎儿均可发生流产。目前针对PCV3的研究尚处于起步阶段，需尽快开展相关检测技术研究，建立PCV3快速、灵敏、特异的病原学和血清学检测方法，鉴于PCV2与PCV3存在交叉免疫保护可能性较低，应加快PCV3毒株的分离与鉴定，为开展疫苗研制及动物回归试验工作奠定基础，保障我国生猪产业健康发展。普通PCR方法成本较低，操作方便，得到了广泛应用。但普通PCR诊断存在灵敏度较低这样的问题，且PCV3亚临床感染猪群中病毒含量很低，普通PCR灵敏度较差，易造成漏检。巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应，使用两对PCR引物扩增目的片段。经过两轮PCR扩增，可以极大程度的提高普通PCR的灵敏度，且两轮PCR引物发生非特异性结合的概率极低。当前圆环病毒3型PCV3检测的靶标多为ORF2，保守性很高，为PCV3复制必需的一种结构蛋白，因此，编码Cap结构蛋白的ORF2基因序列可作为检测PCV3的诊断靶标。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的是在于提供一种快速简便的巢式PCR检测猪圆环病毒3型(PCV3)的方法。为了实现本专利技术的目的，本专利技术是技术方案如下：第一方面，本专利技术提供了一种用于检测猪圆环病毒3型的巢氏PCR引物。通过编码猪圆环病毒3型Cap蛋白ORF2基因部分更保守的碱基序列，以此为基础，设计两对巢式检测引物，所述两对检测引物，分别为外侧引物PCV3-O-F、PCV3-O-R和内侧引物PCV3-I-F、PCV3-I-R，其序列如下：PCV3-O-F：上游引物5’-GTGTGAGTGGATATACCGGGCAGTG-3’(SEQIDNO.1)；PCV3-O-R：下游引物5’-ACCCACCCACCCAATAAATAC-3’(SEQIDNO.2)；PCV3-I-F：上游引物5’-GTGTTTTGATGCCGCAGGAC-3’(SEQIDNO.3)；PCV3-I-R：下游引物5’-AAGGCCTCCAACTTTCCACGAAT-3’(SEQIDNO.4)；其中，外侧引物对应于编码圆环病毒3型(PCV3)Cap蛋白ORF2中的基因区间，内侧引物在外侧引物扩增序列内侧、且对应于编码圆环病毒3型(PCV3)Cap蛋白ORF2中的基因区间。第二方面，本专利技术提供了包含前述引物用于猪圆环病毒3型的检测试剂盒，试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，其中，所述阳性对照为含有猪圆环病毒3型1091bp基因片段的重组质粒，所述阴性对照为RNase-freewater。第三方面，本专利技术还挺提供了一种检测猪圆环病毒的通用型巢式PCR检测方法，具体包括以下步骤：S1、从待检测样品提取DNA；S2、以S1提取的DNA为模板，用权利要求1所述外侧引物进行第一轮PCR扩增，产物进行电泳检测，若无1091bp条带则进行第二轮扩增；S3、以第一轮扩增产物为模板，用权利要求1所述内侧引物进行第二轮扩增，产物用进行电泳检测。作为优选，S1所述待测样品包括猪的血清、脾脏或肺脏。作为优选，S2中的PCR反应体系总体积25μL，其中TaqMix12.5μL，PCV3-O-F、PCV3-O-R各1μL，模板1μL，ddH2O余量；反应条件为95℃预变性5min，95℃30s，60℃45s，72℃1min，共32个循环，最后72℃延伸8min。作为优选，S3中的PCR反应体系总体积25μL，其中TaqMix12.5μL，PCV3-I-F、PCV3-I-R各1μL，模板1μL，ddH2O余量；反应条件为95℃预变性5min，95℃30s，62℃45s，72℃1min，共32个循环，最后72℃延伸8min。本专利技术涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。本专利技术的技术效果为：通过对Cap蛋白的保守的特异性ORF2基因分析，设计出两对具有特异性的引物。进行两轮PCR扩增，第一轮扩增加强PCR的特异性，第二轮扩增加强PCR检测的敏感性，两轮PCR提高了PCR的敏感性和特异性，灵敏度可达2.4个拷贝，实现了对猪圆环病毒3型的精准检测。该检测方法不仅适用于猪的血清、还适用于猪的脾脏、肺脏等组织样品，具有广泛的应用范围，而且该方法操作简便，成本较低。附图说明图1为巢式PCR引物特异性检测的凝胶电泳图，其中M为DL2000DNAMarker，1-8中的模板分别阳性对照、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和阴性对照。图2为巢式PCR引物特异性检测的凝胶电泳图，其中M为DL2000DNAMarker，1-8中的模板分别为阳性对照、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和阴性对照。图3为巢式PCR外侧引物敏感性检测的凝胶电泳图，其中M为DL2000DNAMarker，1-10中模板拷贝数依次为2.4×108，2.4×107，2.4×106，2.4×105，2.4×104，2.4×103，2.4×102，2.4×101，2.4，试剂对照。图4为巢式PCR内侧引物敏感性检测的凝胶电泳图，其中1-10分别以第一次PCR产物为相应模板，2.4×108，2.4×107，2.4×10本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测猪圆环病毒3型的巢氏PCR引物，其特征在于，所述引物根据检测圆环病毒3型Cap蛋白ORF2基因的高度保守的碱基序列设计两对引物，所述引物为一对外侧引物PCV3‑O‑F、PCV3‑O‑R和一对内侧引物PCV3‑I‑F、PCV3‑I‑R，其序列为：PCV3‑O‑F：5’‑GTGTGAGTGGATATACCGGGCAGTG‑3’(SEQ ID NO.1)；PCV3‑O‑R：5’‑ACCCACCCACCCAATAAATAC‑3’(SEQ ID NO.2)；PCV3‑I‑F：5’‑GTGTTTTGATGCCGCAGGAC‑3’(SEQ ID NO.3)；PCV3‑I‑R：5’‑AAGGCCTCCAACTTTCCACGAAT‑3’(SEQ ID NO.4)。

【技术特征摘要】
1.用于检测猪圆环病毒3型的巢氏PCR引物，其特征在于，所述引物根据检测圆环病毒3型Cap蛋白ORF2基因的高度保守的碱基序列设计两对引物，所述引物为一对外侧引物PCV3-O-F、PCV3-O-R和一对内侧引物PCV3-I-F、PCV3-I-R，其序列为：PCV3-O-F：5’-GTGTGAGTGGATATACCGGGCAGTG-3’(SEQIDNO.1)；PCV3-O-R：5’-ACCCACCCACCCAATAAATAC-3’(SEQIDNO.2)；PCV3-I-F：5’-GTGTTTTGATGCCGCAGGAC-3’(SEQIDNO.3)；PCV3-I-R：5’-AAGGCCTCCAACTTTCCACGAAT-3’(SEQIDNO.4)。2.一种猪圆环病毒3型巢式PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的两对引物、阳性对照和阴性对照，所述阴性对照为RNase-freewater，所述阳性对照为含有猪圆环病毒3型1091bp基因片段的重组质粒。3.一种用于检测猪圆环病毒3型的通用型巢氏PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、从待检测样品提取DNA；S2、以S1提取的D...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘国平，同珂，刘艳珍，常小云，胡利群，李文静，
申请(专利权)人：长江大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42