PTPRJ基因作为猪免疫相关性状的分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术属于猪分子标记筛选领域，具体涉及PTPRJ基因作为猪免疫相关性状的分子标记及其应用。本发明专利技术的分子标记克隆自PTPRJ基因的一个片段。其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在该序列的第134碱基位处发生一个等位基因突变，即T/G突变。该基因的SNP突变位点获得的分子标记与猪的免疫相关性状相关。对该分子标记进行了关联分析，发现此多态位点与猪的T淋巴细胞亚型含量、嗜碱性粒细胞数、中性粒细胞百分比、嗜碱性粒细胞百分比、白介素‑10含量、80日龄体重这六个性状呈极显著相关。本发明专利技术的分子标记可作为检测猪免疫性状的相关标记，可用于猪的标记辅助育种上。

PTPRJ gene as molecular marker for pig immune related traits and its application

The invention belongs to the field of pig molecular marker screening, and specifically relates to the PTPRJ gene as a molecular marker for pig immune related traits and its application. The molecular marker of the present invention is cloned from a fragment of PTPRJ gene. Its nucleotide sequence, as shown in SEQ ID NO:1, has an allele mutation at the 134th base of the sequence, i.e. T/G mutation. The molecular marker obtained from the SNP mutation site of this gene is related to the immune correlation of pigs. An association analysis of the marker was carried out. It was found that the polymorphic locus was significantly correlated with the six traits of T lymphocyte subtype, basophil count, neutrophil percentage, basophil percentage, interleukin 10 content, and 80 day weight. The molecular marker of the * * can be used as a marker for detecting pig immune traits and can be used for marker assisted breeding in pigs.

【技术实现步骤摘要】
PTPRJ基因作为猪免疫相关性状的分子标记及其应用
本专利技术涉及猪分子标记筛选领域，具体涉及PTPRJ基因作为猪免疫相关性状的分子标记及其应用。本专利技术所述的分子标记可用于猪免疫相关性状的检测。
技术介绍
世界上生猪养殖业蓬勃发展的同时，也暴露出一些不可忽略的问题。随着生活水平的提高，人们的消费观念发生了明显转变，在对肉制品的要求上，瘦肉率甚至口感已经不再处于第一考量，营养、绿色、健康逐渐成为推动行业升级的方向标。传统养殖方式中疫苗、抗生素等的大量使用明显和大方向不符。在生猪饲养期间，对于疾病处理方面，不规范使用甚至滥用疫苗和抗生素导致了猪体内药物残留，间接对人类造成影响，同时，预混于饲料中的抗生素残留风险也一种额外威胁，有可能诱发共生菌产生耐药性。早在2015年，美国食品及药物管理局(FDA)就提案建议在鸡肉、牛肉和猪肉生产中减少抗菌促生长剂的使用量，欧盟正极力限制第三代头孢菌素在兽药上的使用，荷兰经济部、农业部和创新部也建议减少抗生素的使用量，其中一项措施可能是禁止在饲料内预混药物(黎先伟，2015)。2018年中国农科院饲料研究所启动了饲用抗生素替代研究项目。可以看出，饲用抗生素导致的食品安全和环境安全问题已经在国内外受到了重视。PTPRJ基因编码受体型酪氨酸磷酸酶J，该酶广泛存在于多种细胞类型中(LinJ等，2004)，它有多种底物，包括PDGFb受体(KovalenkoM等，2000)、肝细胞生长因子(HGF)受体(PalkaHL等，2003)、血管内皮生长因子(VEGF)受体-2(LampugnaniMG等，2006)等，是介导细胞基质间相互作用的重要信号分子(LarsenM等，2003)。PTPRJ在血管内皮细胞中的表达水平对于血管发生具有重要作用：低到中度表达水平促进血管内皮钙黏蛋白相关血管生成；高表达水平抑制血管内皮细胞生长因子受体磷酸化激活，对血管内皮细胞生长因子相关血管生成起负性调控作用(许小兵等，2017)。PTPRJ也是一种肿瘤抑制基因，它已经在包括乳腺癌在内的一系列癌症研究中被发现(ChanelE.Smart等，2012)。PTPRJ通过负调控与增殖信号有关的几种蛋白，表现出抑癌活性，其可以与癌症中广泛表达的CD98hc相互作用，PTPRJ过表达可显著降低A549肺癌细胞中CD98hc蛋白水平，还能显著降低肺癌细胞的增殖和诱导凋亡，有助于阐明肿瘤细胞中PTPRJ信号通路(Sabrina等，2018)。在人和小鼠组织中，巨噬细胞的PTPRJ表达量最高(DaveRK等，2009)，敲除试验表明其在单核细胞活化中发挥了与CD45类似的积极作用，可使酪氨酸Src家族的负调控激酶去磷酸化(StepanekO等，2011)。RichaK等人在2013年报导，PTPRJ/CD148是具有肿瘤抑制样活性的酪氨酸磷酸酶，各种细胞和组织的定量PCR试验显示它优先在富含巨噬细胞的组织中表达；在淋巴组织内，免疫组化学试验显示PTPRJ/CD148与F4/80共定位，同样表明巨噬细胞最强烈地表达PTPRJ蛋白质；并且PTPRJ基础水平不仅在巨噬细胞中表达最高，还能通过脂多糖(LPS)和其他Toll样受体配体处理后进一步升高。巨噬细胞是识别、吞噬和破坏外来微生物及其产物的关键细胞，它们是人体免疫系统的重要组成部分。巨噬细胞不仅有吞噬功能还具有抗原呈递的额外作用，因此对先天免疫反应和后天免疫反应发挥最佳功能起着关键作用(StoyN等，2001)。由此，我们合理推测，PTPRJ基因可能参与机体重要的功能，并且它对免疫系统发挥作用有影响，支撑本专利技术的试验结果也表明PTPRJ基因中一个SNP变异与猪的免疫性状显著相关，如果将其作为猪抗病育种工作中的分子标记，可以对抗病性状的研究起到提示作用。因此，本申请专利技术中于PTPRJ基因上发现的一个SNP在猪免疫性状相关分子标记制备领域中具有极大的应用潜力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种与猪免疫性状相关基因PTPRJ的分子标记及其应用。所述的猪免疫性状主要涉及免疫性状CD4-CD8-CD3-、嗜碱性粒细胞数(BA)、中性粒细胞百分比(NE％)、嗜碱性粒细胞百分比(BA％)、白介素-10(IL-10)含量、80日龄体重性状关联的分子标记。利用该分子标记可迅速预测不同基因型群体猪之间免疫性状的差别，同时在猪育种工作中，该分子标记可作为免疫性状的可靠标记，便于进行早期选择，从而缩短世代间隔，提高选择强度，提高猪的标记辅助选种效率和准确性。为实现上述目的，本专利技术提供一种猪免疫性状相关基因PTPRJ的分子标记，所述分子标记位于猪2号染色体PTPRJ基因第25号外显子(E25)的核苷酸序列上，即序列SEQIDNO：1或附图3所示，序列标注位置为第134位的T＞G单核苷酸突变，它对应于ensembl数据库(GRCh37)版本的猪基因组参考转录本PTPRJ-201(GenBank收录号：ENSSSCT00000022326.1)的cDNA序列第6104位核苷酸，也对应于猪全基因组(Sscrofa10.2)第2号染色体上第15633547位核苷酸，RS号为rs333210306。SEQIDNO：1所述序列具体为：CGGATGCCCCGCGGGCCCCGGGGTGTTGGGTGCAGCTGGGTGTGGGCGGATGGCTTCCGGGCCTGCACAAGTGGCCTGCCCCTGGCACGCAAGCCTTGCAGAGCTCTGTGACTTCTTCAGAGGTCCCTGTTCAR(T/G)GCGGCAGTTCTGTGCGCCACACCCCTTCCCACTCCAGTTCCTCAGGAAACCATGGTGATGGGGGCCGGGCGTCAAATCCCACGTGGACGTACGCCCCGCCCACAGCACTGCCGCTG上述序列第134位碱基处R是T/G的基因突变(序列表SEQIDNO：1中第134位的碱基是突变后的碱基G)，该突变使上述序列产生了多态性。该序列可以作为检测与猪免疫性状相关的分子标记。申请人提供了一种筛选猪免疫性状相关分子标记的方法，所述方法的步骤如下：1.按常规方法提取若干头猪耳朵基因组DNA混成DNA池，并对DNA进行质量检测，以ensembl数据库(GRCh37)版本上公布的猪基因组参考转录本PTPRJ-201的cDNA序列为模板扩增PTPRJ基因，并送到北京六合华大基因公司进行基因测序。2.利用MegAlign软件对测序结果与参考序列进行比对分析，发现PTPRJ基因25号外显子上存在着一突变位点，依据其在参考转录本上的位置信息，定位得到ensembl数据库上的rs333210306。3.根据比对结果列出包含该SNP位点在内的上下游各大于100bp的序列，以此作为分型序列。4.按常规方法提取294头猪耳朵基因组DNA，并对DNA进行质量检测。5.利用质谱分型技术(华大基因SequenomMassArray，具体步骤见说明书文末)对PTPRJ基因的SNP进行分型。此外，申请人还提供了一种应用该分子标记与猪免疫性状进行关联分析的方法：具体步骤为：采用免费软件R(3.2.4)中gaston包进行数据处理与统计分析。采集样品的白细胞数、嗜中性粒细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪免疫性状中T淋巴细胞亚型含量、嗜碱性粒细胞数、中性粒细胞百分比、嗜碱性粒细胞百分比、白介素‑10含量、80日龄体重性状关联的分子标记，其特征在于，所述的分子标记的核苷酸序列如下所示：CGGATGCCCCGCGGGCCCCGGGGTGTTGGGTGCAGCTGGGTGTGGGCGGATGGCTTCCGGGCCTGCACAAGTGGCCTGCCCCTGGCACGCAAGCCTTGCAGAGCTCTGTGACTTCTTCAGAGGTCCCTGTTCA RGCGGCAGTTCTGTGCGCCACACCCCTTCCCACTCCAGTTCCTCAGGAAACCATGGTGATGGGGGCCGGGCGTCAAATCCCACGTGGACGTACGCCCCGCCCACAGCACTGCCGCTG，上述序列中的第134碱基位的R是T或G，该突变导致多态性。

【技术特征摘要】
1.一种猪免疫性状中T淋巴细胞亚型含量、嗜碱性粒细胞数、中性粒细胞百分比、嗜碱性粒细胞百分比、白介素-10含量、80日龄体重性状关联的分子标记，其特征在于，所述的分子标记的核苷酸序列如下所示：CGGATGCCCCGCGGGCCCCGGGGTGTTGGGTGCAGCTGGGTGTGGGCGGATGGCTTCCGGGCCTGCACAAGTGGCCTGCCCCTGGCACGCAAGCCTTGCAGAGCTCTGTGACTTCTTCAGAGGTCCCTGTTCAR...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱猛进，吴雅兰，张伟，周光亮，王道远，陈逸俊，安美景，赵书红，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42