一种发酵脱脂米糠硫酸化的新方法技术

本发明专利技术公开了一种发酵脱脂米糠硫酸化的新方法，先把脱脂米糠半干发酵，通过生物的过程改造多糖分子，然后直接经过硫酸化，省略了传统的先提取、纯化多糖，再硫酸化的多个步骤；并且经过生物与化学双过程减小多糖分子量，使多糖功能化，增加多糖的利用率。本发明专利技术发酵脱脂米糠硫酸化新方法，先经过生物过程使多糖分子量减小，并容易解离出，生物过程后进行直接硫酸化，减少先提取、提纯等再硫酸化常规办法，过程环保、节约人力物力，收率高，硫酸化过程从环保角度，改用无味、沸点低、易处理试剂。

A New Method for Sulfation of Fermented Degreased Rice Bran

The present invention discloses a new method for sulfating defatted rice bran by fermentation. First, the defatted rice bran is semi-dry fermented, the polysaccharide molecule is modified by biological process, then the polysaccharide molecule is directly sulfated, omitting the traditional steps of extracting and purifying the polysaccharide before sulfating, and the molecular weight of the polysaccharide is reduced through biological and chemical double processes, so that the polysaccharide is functionalized and the utilization of the polysaccharide is Rate. The new sulfation method of fermented defatted rice bran of the invention reduces the molecular weight of polysaccharides through biological process and is easy to dissociate. After biological process, polysaccharides are directly sulfated to reduce conventional sulfation methods such as extraction, purification and so on. The process is environmentally friendly, saves manpower and material resources, and has high yield. From the point of view of environmental protection, the sulfation process is replaced by odorless, low boiling point and easy-to-treat reagents.

【技术实现步骤摘要】
一种发酵脱脂米糠硫酸化的新方法
本专利技术属于生物、化学改性天然物分子应用于抗病毒生物活性的领域，具体涉及到生物、化学改性脱脂米糠，获得发酵多糖硫酸酯在体外表现出强于未硫酸化的发酵多糖抗病毒活性，一种发酵脱脂米糠硫酸化的新方法。
技术介绍
米糠非淀粉多糖包括纤维素、半纤维素、果胶，是构成细胞壁的主要成分，其中纤维素在细胞壁中起到支撑作用，被称为结构性多糖，半纤维素和果胶类在细胞壁中起到填充作用和连接作用，被称为基质多糖。半纤维素包括α-葡聚糖、阿拉伯木聚糖、葡糖甘露聚糖等，果胶类多糖包括阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖、聚鼠李半乳糖醛酸、同聚半乳糖醛酸。提取油脂后米糠大约含有50％膳食纤维，20％蛋白质以及10％植酸钙，可以用来开发高附加值的产品，如米糠非淀粉多糖、米糠蛋白、植酸。在不同提取工艺下，由于不同结构层的细胞壁性质不同，从而制备米糠多糖的溶解性、单糖组成，分子量，糖链构象，空间结构，生物活性均有所差别。对于多糖而言，单糖残基上官能团较少、支化程度不高、分子量相对较高的多糖生物活性相对较低，而其较低的水溶性更是进一步限制了其生物活性的发挥，因此化学研究者们研究了各种分子修饰的方法制备多糖的衍生物，改善其生物活性。常见的多糖结构修饰有物理修饰、化学修饰(硫酸化、磷酸化、乙酰化等)和生物工程修饰。枯草芽孢杆菌在生长代谢过程中可产生大量的蛋白酶、植酸酶、纤维素酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶及其他有益因子。脱脂米糠先半干发酵，其中多糖分子量和单糖的分布会有所变化。硫酸酯化是对多糖进行结构修饰改性的一种较为常见方法。经硫酸酯化修饰处理之后，多糖的分子量减小、水溶性增加、电荷改变、生物活性明显增加，而且在一定分子量和硫酸取代度范围内，多糖硫酸酯的功能活性与硫酸取代度呈现正相关，因此将多糖进行硫酸酯化修饰的方法才会被广泛地使用和研究。常见的硫酸酯化方法主要有浓硫酸法、氯磺酸-吡啶法、三氧化硫-有机碱法。三种方法都是先将硫酸化试剂(浓硫酸、氯磺酸、三氧化硫-吡啶或者三氧化硫-三乙胺)在冷却条件下溶于溶剂，制备成酯化试剂，再升温与多糖或者多糖的溶液反应。浓硫酸法会在一定程度上水解多糖，得到的产品存在产率低的问题。氯磺酸-吡啶法产率较好，是国内常用的硫酸酯化方法，但氯磺酸有一定危险性，是国家控制原料。三氧化硫-有机碱法则是较为安全的、反应条件温和、但试剂较为昂贵，不易反应。天然和人工合成的多糖硫酸酯也被众多试验证明在抗凝血、抗HIV、抗病毒、抗肿瘤、增强机体免疫活性等方面有显著功效，许多多糖在经过硫酸酯化修饰后，活性有大幅度的提高。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的不足之处作出了改进，提供了一种发酵脱脂米糠硫酸化的新方法，本专利技术具体是通过如下技术方案来实现的：本专利技术公开了一种发酵脱脂米糠硫酸化的新方法，先把脱脂米糠半干发酵，通过生物的过程改造多糖分子，然后直接经过硫酸化，省略了传统的先提取、纯化多糖，再硫酸化的多个步骤；并且经过生物与化学双过程减小多糖分子量，使多糖功能化，增加多糖的利用率。作为进一步地改进，本专利技术的具体步骤为：1)、称取脱脂米糠，加一定的纯净水与枯草芽孢杆菌半干法进行发酵；2)、取有机溶剂于干燥的瓶中，冷却，搅拌下滴加发烟硫酸，得硫酸酯化试剂备用；3)、称取干燥发酵米糠,加入有机溶剂，冷却后，在搅拌情况下，缓慢滴加步骤2)中的硫酸酯化试剂，滴加完毕充分冷却后，再于水浴中搅拌反应，反应完毕后冷却，中和至pH＝7，抽滤，旋转蒸发，冷冻干燥即得粗品；4)、将步骤3)得到的粗品进一步透析、柱分离处理，冷冻干燥后即得纯品。作为进一步地改进，本专利技术所述的脱脂米糠半干法进行发酵是加15％的纯净水与0.1％的枯草芽孢杆菌，发酵72小时。作为进一步地改进，本专利技术所述的步骤3)中，发酵米糠与有机溶剂的质量比例为1：10。作为进一步地改进，本专利技术所述的的步骤3)中，发酵米糠与发烟硫酸的质量比例为1：10～18。作为进一步地改进，本专利技术所述的步骤3)中，发酵米糠硫酸化的时间在1～4小时。作为进一步地改进，本专利技术所述的有机溶剂是乙腈，所述的硫酸酯化试剂是发烟硫酸的乙腈溶剂，所述的发烟硫酸占乙腈溶液的质量比为50～70％。作为进一步地改进，本专利技术米糠硫酸化多糖取代度为1.0～1.4。本专利技术采用发烟硫酸乙腈溶液，乙腈沸点、低易处理，先把脱脂米糠半干发酵，通过生物的过程改造多糖分子，然后直接经过硫酸化，省略了先提取、纯化多糖，再硫酸化的多步步骤，并且经过生物与化学双过程减小多糖分子量，使多糖功能化，并且增加多糖的提取率。本专利技术先经过生物过程，然后是化学修饰双过程直接改变米糠，使米糠的多糖的分子量分布发生变化；米糠的多糖的单糖的占比发生变化，制备而成的发酵米糠硫酸化多糖对病毒有抑制作用。获得的硫酸化的多糖CY1，经过纯化，鉴定，进行体外抗病毒细胞毒实验，活性优于未硫酸化的米糠多糖。专利的优势：1、发酵脱脂米糠硫酸化新方法，先经过生物过程使多糖分子量减小，并容易解离出。2、生物过程后进行直接硫酸化，减少先提取、提纯等再硫酸化常规办法，过程环保、节约人力物力，收率高。3、硫酸化过程从环保角度，改用无味、沸点低、易处理试剂。附图说明图1是吸光度对硫酸根浓度标准曲线图(硫酸钾)；图2是不同分子量葡聚糖的标准曲线图；图3是样品1(发酵米糠硫酸化4小时产品)的分子量分布图；图4是样品2(未发酵米糠硫酸化4小时产品)的分子量分布图；图5是90μg/mg单糖标准品色谱图；图6是样品1(发酵米糠硫酸化4小时产品)的单糖分布图；图7是样品2(未发酵米糠硫酸化4小时产品)的单糖分布图。具体实施方式以下结合实施例来进一步说明本专利技术。实施例1称500g脱脂米糠半干法进行发酵。加15％的纯净水与0.1％的枯草芽孢杆菌，发酵72小时。干燥。取无水乙腈1000g于干燥的瓶中，冷却0℃，搅拌下滴加发烟硫酸2000g，即为硫酸酯化试剂，备用。50g干燥发酵米糠加500g乙腈，冷却至0℃后，在搅拌情况下，缓慢滴加硫酸酯化试剂1350g，滴加完毕之后，于0℃充分冷却后，再于35℃水浴中搅拌反应4小时。反应完毕后将烧瓶0℃冷却，搅拌滴加20％氢氧化钠溶液中和，至pH＝7，抽滤，旋转蒸发，冷冻干燥即得粗品46g。分别用MD55透析袋去离子水透析2天，浓缩后，过凝胶色谱柱(超细SephadexLH-20，去离子水),流动相为去离子水，流速0.4mL/min，TLC检测成分(展开剂丙酮：正丁醇：水＝1：1：1，显色剂：10％硫酸-甲醇溶液)，收集目标馏分，冷冻干燥即得纯品30g，得样品1(CY1)。对比例150g干燥脱脂米糠加500g乙腈，冷却至0℃后，在搅拌情况下，缓慢滴加硫酸酯化试剂1350g，滴加完毕之后，于0℃充分冷却后，再于35℃水浴中搅拌反应4小时。反应完毕后将烧瓶0℃冷却，搅拌滴加20％氢氧化钠溶液中和，至pH＝7，抽滤，旋转蒸发，冷冻干燥即得粗品42g。分别用MD55透析袋去离子水透析2天，浓缩后，过凝胶色谱柱(超细SephadexLH-20，去离子水),流动相为去离子水，流速0.4mL/min，TLC检测成分(展开剂丙酮：正丁醇：水＝1：1：1，显色剂：10％硫酸-甲醇溶液)，收集目标馏分，冷冻干燥即得纯品27g，得样品2。实施例2称500g脱脂米糠半干本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种发酵脱脂米糠硫酸化的新方法，其特征在于，先把脱脂米糠半干发酵，通过生物过程改造多糖分子，然后直接经过硫酸化，省略了传统的先提取、纯化多糖，再硫酸化的多个步骤；并且经过生物与化学双过程减小多糖分子量，使多糖功能化，增加多糖的利用率。

【技术特征摘要】
1.一种发酵脱脂米糠硫酸化的新方法，其特征在于，先把脱脂米糠半干发酵，通过生物过程改造多糖分子，然后直接经过硫酸化，省略了传统的先提取、纯化多糖，再硫酸化的多个步骤；并且经过生物与化学双过程减小多糖分子量，使多糖功能化，增加多糖的利用率。2.根据权利要求1所述的发酵脱脂米糠硫酸化的新方法，其特征在于，具体步骤为：1)、称取脱脂米糠，加一定的纯净水与枯草芽抱杆菌半干法进行发酵；2)、取有机溶剂于干燥的瓶中，冷却，搅拌下滴加发烟硫酸，得硫酸酯化试剂备用；3)、称取干燥发酵米糠,加入有机溶剂，冷却后，在搅拌情况下，缓慢滴加步骤2)中的硫酸酯化试剂，滴加完毕充分冷却后，再于水浴中搅拌反应，反应完毕后冷却，中和至pH＝7，抽滤，旋转蒸发，冷冻干燥即得粗品；4)、将步骤3)得到的粗品进一步透析、柱分离处理，冷冻干燥后即得纯品。3.根据权利要求2所述的发酵脱脂米糠硫酸化的新方法，其特征在于，所述的脱脂米糠半干法进行发酵是加15％的纯净水...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔艳丽，毛旸易，赵云龙，毛建卫，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33