一种低分子量硫酸软骨素及其制备工艺与在治疗阿尔茨海默病中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种低分子量硫酸软骨素及其制备工艺与在治疗阿尔茨海默病中的应用，本发明专利技术通过使用生物发酵剂与深海鱼骨进行发酵，提取得到一种低分子量(6000‑10000Da)的硫酸软骨素，该硫酸软骨素对小鼠AD模型、PC12细胞都显示出积极作用，效果明显优于普通方法获得的CS(市售鲨鱼骨来源的硫酸软骨素)及先前专利报道的低分子量硫酸软骨素(

A Low Molecular Weight Chondroitin Sulfate and Its Preparation and Application in the Treatment of Alzheimer's Disease

The present invention relates to a low molecular weight chondroitin sulfate and its preparation process and its application in the treatment of Alzheimer's disease. The low molecular weight chondroitin sulfate (6000 10000Da) is extracted by fermentation with biological fermentation agent and deep-sea fish bone. The chondroitin sulfate has a positive effect on AD model and PC12 cells of mice, and the effect is obviously better than that of common method. CS (Chondroitin Sulfate from Shark Bone on Market) and Low Molecular Weight Chondroitin Sulfate Reported in Previous Patents\uff08

【技术实现步骤摘要】
一种低分子量硫酸软骨素及其制备工艺与在治疗阿尔茨海默病中的应用
本专利技术属于生物发酵提取及医药领域，具体涉及一种低分子量硫酸软骨素及其制备工艺与在治疗阿尔茨海默病中的应用。
技术介绍
阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)是德国精神病学和神经发病学家AlzheimerAlois于1906年首次发现并命名的中枢神经系统退行性疾病。AD患者主要的临床表现为认知功能障碍、记忆力减退、智商低能、语言表达不清和行为诡异等(叶勤,李海林,李箕君.阿尔茨海默病与血管性痴呆患者精神行为症状和认知功能损害的比较[J].临床精神医学杂志.2015,25(1):46-47.)。鉴于此病多发于60岁以上人群，亦称“老年性痴呆”；其实不然，由于AD导致的痴呆占总痴呆病例的60-80％，故而得名(张旻,黄晓琳,张凤霞.重复经颅磁刺激在阿尔茨海默病治疗中的作用[J].内科急危重症杂志.2017,23(3):177-181.)。人类进入21世纪，全球人口老龄化加剧，特别是80岁以上老人中高达70-80％伴有不同程度的痴呆病症(赵文姣,孙德群.以糖原合成酶激酶-3为靶标的抗老年痴呆新药研究进展[J].有机化学.2018,38:1596-1607.)；所以，AD将成为全社会医疗、健康和维稳最重的负担之一。因此，发现和研制高效低毒的AD防治药物是目前的迫切任务。硫酸软骨素(ChondroitinSulfate，CS)属于糖胺聚糖类(Glycosaminoglycans，GAGs)物质，以蛋白聚糖的形式广泛分布于动物的软骨、皮肤、玻璃体及血管等组织中，根据结构特点CS可分为CS-A，CS-B，CS-C，CS-D，CS-E，CS-F，CS-H，CS-K，CS-L和CS-M等，常见的CS中，CS-A是GalNAc的O-4位硫酸化，CS-B是GalNAc的O-4位和GlcA的O-2位硫酸化，CSC是GalNAc的O-6位硫酸化，CS-D是GalNAc的O-6位和GlcA的O-2位硫酸化，CS-E是GalNAc的O-6位和O-4位硫酸化(王金凤，等，硫酸软骨素的结构和相对分子质量对其生物活性影响的研究进展[J].药物生物技术.2014,21(2):185-188.)。目前利用鱼骨等动物骨提取硫酸软骨素的方法主要有碱提法、中性盐提法和酶提法等方法，不同提取方法得到的CS其硫酸化位点、硫酸化程度、相对分子量(Mr)等均存在差异，这些差异往往是影响CS生物活性的关键因素。已有报道，采用鲨鱼软骨来源的低分子量(<5000Da)硫酸软骨素(ChondroitinSulfate，CS)用于治疗、改善或预防认知功能衰退相关的神经系统疾病(例如AD，CN103342758A)。为了获得一种对AD有显著疗效的新型低硫酸软骨素，本专利技术利用生物发酵技术对鱼骨(鲨鱼骨、鮟鱇鱼骨、鲟鱼骨和比目鱼骨)中硫酸软骨素进行提取和纯化，获得一种高纯度低分子量的硫酸软骨素(6000-10000Da)。
技术实现思路
本专利技术提供一种低分子量硫酸软骨素，其特征在于所述低分子量硫酸软骨素的制备方法包括如下步骤：(1)将干燥的深海鱼骨粉碎后与生物发酵剂、水混合均匀，于30-42℃下，发酵5-12小时后，收集发酵液；(2)向步骤(1)得到的发酵液中加入氯化钠或氯化钠溶液使体系中氯化钠的浓度达1-3mol/L，再调pH至6-7，于10-20℃下搅拌3-8小时后，再加氢氧化钠或氢氧化钠溶液调pH至12-13，保持10-20℃搅拌8-16小时后，过滤、收集滤液；(3)向步骤(2)得到的滤液中加入盐酸调pH至7-9，并升温至70-85℃，搅拌10-30分钟后，过滤，收集滤液；(4)向步骤(3)得到的滤液中加入盐酸调pH至2-3，室温下搅拌10-15分钟后，过滤，收集滤液；(5)向步骤(4)得到的滤液中加入氢氧化钠或氢氧化钠溶液调pH至5.0-6.5，并于室温下，任选加入适量的水使体系中氯化钠的浓度达1.0mol/L，并加入无水乙醇或乙醇溶液使体系中乙醇的体积分数达40-60％；静置16-48小时后，收集沉淀、干燥即得所述低分子量硫酸软骨素。步骤(1)中所述的深海鱼骨选自鲨鱼骨、鮟鱇鱼骨、鲟鱼骨、比目鱼骨中的一种或几种；所述粉碎优选粉碎至10-20目；所述生物发酵剂选自酶类或微生物菌剂，优选微生物菌剂，其中酶类选自风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶等；微生物菌剂选自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、酵母菌。所述酶的活力≥20U/mg，所述微生物菌剂的有效菌数≥108CFU/g，优选≥109CFU/g。深海鱼骨、生物发酵剂、水的质量比为1:0.1-2:2-8，优选1:0.1-0.5:2-5。步骤(5)中所述收集沉淀选自采用离心或过滤收集沉淀的方法，所述干燥选自冷冻干燥或真空干燥。本专利技术所述低分子量硫酸软骨素的重均分子量优选为6000-10000Da，进一步优选为6000-9000Da。本专利技术的另一实施方案提供上述低分子量硫酸软骨素的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将干燥的深海鱼骨粉碎后与生物发酵剂、水混合均匀，于30-42℃下，发酵5-12小时后，收集发酵液；(2)向步骤(1)得到的发酵液中加入氯化钠或氯化钠溶液使体系中氯化钠的浓度达1-3mol/L，再调pH至6-7，于10-20℃下搅拌3-8小时后，再加氢氧化钠或氢氧化钠溶液调pH至12-13，保持10-20℃搅拌8-16小时后，过滤、收集滤液；(3)向步骤(2)得到的滤液中加入盐酸调pH至7-9，并升温至70-85℃，搅拌10-30分钟后，过滤，收集滤液；(4)向步骤(3)得到的滤液中加入盐酸调pH至2-3，室温下搅拌10-15分钟后，过滤，收集滤液；(5)向步骤(4)得到的滤液中加入氢氧化钠或氢氧化钠溶液调pH至5.0-6.5，并于室温下，任选加入适量的水使体系中氯化钠的浓度达1.0mol/L，并加入无水乙醇或乙醇溶液使体系中乙醇的体积分数达40-60％；静置16-48小时后，收集沉淀、干燥即得所述低分子量硫酸软骨素。步骤(1)中所述的深海鱼骨选自鲨鱼骨、鮟鱇鱼骨、鲟鱼骨、比目鱼骨中的一种或几种；所述粉碎优选粉碎至10-20目；所述生物发酵剂选自酶类或微生物菌剂，优选微生物菌剂，其中酶类选自风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶等；微生物菌剂选自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、酵母菌。所述酶的活力≥20U/mg，所述微生物菌剂的有效菌数≥108CFU/g，优选≥109CFU/g。深海鱼骨、生物发酵剂、水的质量比为1:0.1-2:2-8，优选1:0.1-0.5:2-5。步骤(5)中所述收集沉淀选自采用离心或过滤收集沉淀的方法，所述干燥选自冷冻干燥或真空干燥。本专利技术所述低分子量硫酸软骨素的重均分子量优选为6000-10000Da，进一步优选为6000-9000Da。本专利技术的另一实施方案提供上述低分子量硫酸软骨素在制备治疗、改善和/或预防认知功能衰退相关的神经系统疾病的药物中的应用。所述神经系统疾病优选阿尔茨海默病。本专利技术的另一实施方案提供一种药物组合物，其特征在于所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种低分子量硫酸软骨素，其特征在于所述低分子量硫酸软骨素的制备方法包括如下步骤：(1)将干燥的深海鱼骨粉碎后与生物发酵剂、水混合均匀，于30‑42℃下，发酵5‑12小时后，收集发酵液；(2)向步骤(1)得到的发酵液中加入氯化钠或氯化钠溶液使体系中氯化钠的浓度达1‑3mol/L，再调pH至6‑7，于10‑20℃下搅拌3‑8小时后，再加氢氧化钠或氢氧化钠溶液调pH至12‑13，保持10‑20℃搅拌8‑16小时后，过滤、收集滤液；(3)向步骤(2)得到的滤液中加入盐酸调pH至7‑9，并升温至70‑85℃，搅拌10‑30分钟后，过滤，收集滤液；(4)向步骤(3)得到的滤液中加入盐酸调pH至2‑3，室温下搅拌10‑15分钟后，过滤，收集滤液；(5)向步骤(4)得到的滤液中加入氢氧化钠或氢氧化钠溶液调pH至5.0‑6.5，并于室温下，任选加入适量的水使体系中氯化钠的浓度达1.0mol/L，并加入无水乙醇或乙醇溶液使体系中乙醇的体积分数达40‑60％；静置16‑48小时后，收集沉淀、干燥即得所述低分子量硫酸软骨素。

【技术特征摘要】
1.一种低分子量硫酸软骨素，其特征在于所述低分子量硫酸软骨素的制备方法包括如下步骤：(1)将干燥的深海鱼骨粉碎后与生物发酵剂、水混合均匀，于30-42℃下，发酵5-12小时后，收集发酵液；(2)向步骤(1)得到的发酵液中加入氯化钠或氯化钠溶液使体系中氯化钠的浓度达1-3mol/L，再调pH至6-7，于10-20℃下搅拌3-8小时后，再加氢氧化钠或氢氧化钠溶液调pH至12-13，保持10-20℃搅拌8-16小时后，过滤、收集滤液；(3)向步骤(2)得到的滤液中加入盐酸调pH至7-9，并升温至70-85℃，搅拌10-30分钟后，过滤，收集滤液；(4)向步骤(3)得到的滤液中加入盐酸调pH至2-3，室温下搅拌10-15分钟后，过滤，收集滤液；(5)向步骤(4)得到的滤液中加入氢氧化钠或氢氧化钠溶液调pH至5.0-6.5，并于室温下，任选加入适量的水使体系中氯化钠的浓度达1.0mol/L，并加入无水乙醇或乙醇溶液使体系中乙醇的体积分数达40-60％；静置16-48小时后，收集沉淀、干燥即得所述低分子量硫酸软骨素。2.权利要求1所述的低分子量硫酸软骨素，其特征在于步骤(1)所述生物发酵剂选自酶类或微生物菌剂，优选微生物菌剂，其中酶类选自风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶等；微生物菌剂选自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、酵母菌。3.权利要求1-2任一项所述的低分子量硫酸软骨素，其特征在于步骤(1)所述酶的活力≥20U/mg，所述微生物菌剂的有效菌数≥108CFU/g，优选≥109CFU/g。4.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：林嗣松，王四旺，
申请(专利权)人：林嗣松，王四旺，
类型：发明
国别省市：陕西,61