一种木犀草素的体外抗炎的方法技术

一种木犀草素的体外抗炎的方法，以RAW2647细胞为研究对象，选用对数生长期的细胞，45μmol/L木犀草素，加入药物30min后再加入终浓度为1μg/mL的LPS继续培养12h，采用酶免疫测定法（EIA）检测木犀草素对RAW2647细胞前列腺素E２(PGE2）生成的影响；电泳迁移率变动分析法(EMSA)检测NFκB的DNA结合活性；逆转录聚合酶链反应（RTPCR）测定RAW2647细胞中COX2 mRNA的水平；Western blot法测定RAW2647细胞中NFκB和COX2蛋白的表达。

An in vitro anti-inflammatory method of Luteolin

【技术实现步骤摘要】
一种木犀草素的体外抗炎的方法
本专利技术涉及一种木犀草素的体外抗炎的方法，具体地说是以一种木犀草素的体外抗炎的方法。
技术介绍
目前公知的木犀草素(Luteolin)属于黄酮类化合物，主要存在于菊花、忍冬花、紫苏叶等天然药物中，研究表明木犀草素具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调节等多种作用，木犀草素的抗炎作用与其抑制炎症介质的释放和核因子κB（NFκB）介导的基因表达有关。
技术实现思路
材料与方法；药品及试剂木犀草素（纯度＞98%）和前列腺素E2酶免疫分析试剂盒（PGE2EIAKit）均为美国Cayman公司产品；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、二甲基亚砜（DMSO）、焦碳酸乙二酯（DEPC）等为Sigma公司产品；RPMI1640为Gibco公司产品；超级小牛血清为杭州四季青生物工程公司产品；总RNA提取试剂（Trizol）为Invitrogen公司产品；逆转录聚合酶链反应（RTPCR）一步法试剂盒为宝生物（大连）工程有限公司产品；100bpDNAmarker、N,N,N,N四甲基乙二胺（TEMED）、6倍上样缓冲液均为华美生物工程公司产品；增强化学发光（ECL）试剂、抑酞酶（Aprotinin）均购于上海华舜生物工程有限公司；βactin山羊IgG多克隆抗体、NFκB小鼠IgG单克隆抗体和COX2山羊IgG多克隆抗体均为北京中山公司产品；聚偏(二)氟乙烯（PVDF）膜为美国PallGelman公司产品；NFκB寡核苷酸链为上海生物工程公司产品；γ32P标记三磷酸腺苷（［γ32P］ATP）为北京亚辉生物工程公司产品；T4噬菌体多核苷酸激酶为Promega公司产品。方法；细胞培养RAW2647细胞(小鼠单核/巨噬细胞系)购自上海细胞研究所，在37℃、体积分数为5%CO2条件下，用含体积分数为10%小牛血清、青霉素(1×105U/L)及链霉素(100mg/L)的RPMI1640培养液传代培养。2PGE2含量测定将对数生长期的RAW2647细胞接种于6孔培养板中，设空白对照组，脂多糖（LPS）处理组（模型组），5、15、45μmol/L木犀草素处理组（中药低、中、高剂量组）；药物加入30min后再加入终浓度为1μg/mL的LPS，继续培养12h；收集细胞培养液，以PGE2EIAKit测定其中的PGE2浓度，每组重复3次。电泳迁移率变动分析(EMSA)细胞培养及分组同。细胞核蛋白的提取：细胞以冷磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次后加入100μL缓冲液A［10mmol/LN2羟基哌嗪N2乙磺酸（HEPES）-KOH、15mmol/LMgCl2、10mmol/LKCl、1mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）、10mg/LLeupeptin、35mg/L抑酞酶（Aprotinin）、1mmol/L二硫苏糖醇（DTT）］，冰上放置15min，再加体积分数为10%壬基酚聚氧乙烯醚（NP40）10μL，振荡混匀；然后10000g、4℃、离心10min；于沉淀中加100μL缓冲液B［20mmol/LHEPESKOH、27mol/L甘油（Glycerol）、420mmol/LNaCl、15mmol/LMgCl2、1mmol/LPMSF、1mg/LLeupeptin、10mg/LAprotinin、1mmol/LDTT］，冰浴30min，离心取上清液，考马斯亮蓝法测定核蛋白浓度后，－70℃保存。取10μg核蛋白与放射性核素标记的DNA探针在室温进行结合反应30min，总体积为10μL。DNA蛋白复合物经40g/L的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压110V，电泳60min。真空负压加热干燥凝胶后，－70℃放射自显影，显影后扫描至计算机。用Bandscan43图像分析软件进行光密度积分值分析。每个图像均重复分析3次，取平均值。RTPCR测RAW2647细胞中COX2mRNA的表达RAW2647细胞分组及处理同。收集细胞，用Trizol试剂提取细胞的总RNA，按一步法试剂盒步骤进行RTPCR。COX2引物为：COX2的反应条件为：50℃逆转录30min；94℃预变性2min；94℃变性45s，56℃复性1min，72℃延伸1min，扩增30个循环；72℃延伸10min。PCR产物以15g/L琼脂糖凝胶电泳，DocGel1000成像系统观察结果并拍照。同时进行光密度积分值分析，以COX2PCR产物与内参照βactinPCR产物的光密度积分值之比作为COX2mRNA的相对含量值。Westernblot测RAW2647细胞中COX2和NFκB蛋白的表达细胞处理同，细胞裂解液裂解细胞后提取总蛋白，考马斯亮蓝法测定样品总蛋白含量。每组各取50μg蛋白质样品加上样缓冲液煮沸变性后，进行100g/L十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)；电转移至PVDF膜；用含50g/L脱脂奶粉的Tris缓冲盐溶液(TBS，pH80)封闭2h；分别加入适量COX2、NFκB和βactin多克隆抗体，摇床上室温反应2h；洗膜3次，加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温反应2h；洗膜后作ECL化学发光，X片曝光显影。图像经扫描仪扫描后，用图像分析软件BandScan43进行光密度积分值分析，以目的蛋白与内参照βactin蛋白表达量的光密度积分值之比作为目的蛋白表达量的相对含量值。处理采用SPSS110统计软件进行。结果：木犀草素能显著性抑制LPS诱导的RAW2647细胞PGE2的生成，降低NFκB的DNA结合活性；下调LPS诱导的RAW2647细胞COX2mRNA、NFκB和COX2蛋白的表达。专利技术目的：木犀草素(Luteolin)属于黄酮类化合物，主要存在于菊花、忍冬花、紫苏叶等天然药物中，研究表明木犀草素具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调节等多种作用，木犀草素的抗炎作用与其抑制炎症介质的释放和核因子κB（NFκB）介导的基因表达有关。本文观察了木犀草素对脂多糖(LPS)诱导的RAW2647细胞NFκB表达、DNA结合活性以及对环氧合酶2(COX2)表达的影响，以进一步探讨木犀草素抗炎的作用机理。技术方案：以RAW2647细胞为研究对象，选用对数生长期的细胞，分别设空白对照组，脂多糖(LPS)处理组(模型组)，5、15、45μmol/L木犀草素处理组(中药低、中、高剂量组)；加入药物30min后再加入终浓度为1μg/mL的LPS继续培养12h，分别采用酶免疫测定法（EIA）检测木犀草素对RAW2647细胞前列腺素E２(PGE2）生成的影响；电泳迁移率变动分析法(EMSA)检测NFκB的DNA结合活性；逆转录聚合酶链反应（RTPCR）测定RAW2647细胞中COX2mRNA的水平；Westernblot法测定RAW2647细胞中NFκB和COX2蛋白的表达。专利技术有益效果：木犀草素的抗炎作用可能与其能抑制核内NFκB的表达和DNA结合活性从而下调COX2的表达有关。最佳实施方式：运用药物治疗。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一种木犀草素的体外抗炎的方法，以RAW2647细胞为研究对象，选用对数生长期的细胞，45μmol/L木犀草素，加入药物30min后再加入终浓度为1μg/mL的LPS继续培养12h，采用酶免疫测定法（EIA）检测木犀草素对RAW2647细胞前列腺素E２(PGE2）生成的影响；电泳迁移率变动分析法(EMSA)检测NFκB的DNA结合活性；逆转录聚合酶链反应（RTPCR）测定RAW2647细胞中COX2 mRNA的水平；Western blot法测定RAW2647细胞中NFκB和COX2蛋白的表达。

【技术特征摘要】
1.一种木犀草素的体外抗炎的方法，以RAW2647细胞为研究对象，选用对数生长期的细胞，45μmol/L木犀草素，加入药物30min后再加入终浓度为1μg/mL的LPS继续培养12h，采用酶免疫测定法（EIA）检测木犀草素对RAW2647细胞前列腺素E２(PGE2）生成的影响；电泳迁移率变动分析法(EMSA)检测NFκB的DNA结合活性；逆转录聚合酶链反应（RTPCR）测定RAW2647细胞中COX2mRNA的水平；Westernblot法测定RAW2647细胞中NFκB和COX2蛋白的表达。2.根据权利要求1所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：王燕侠，
申请(专利权)人：王燕侠，
类型：发明
国别省市：甘肃,62