一种亚砷酸对人肺腺癌细胞体外抑制的方法技术

一种亚砷酸对人肺腺癌细胞体外抑制的方法，以体外培养的人肺腺癌细胞株（LAC）细胞为研究对象，选用对数生长期细胞，培养24h后，分别加入不同浓度的亚砷酸（0.75、1.0、1.5、2.0mg/L)，采用倒置相差显微镜观察细胞形态，四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测LAC细胞的生长抑制率；酶联免疫吸附（ELISA）法检测p53基因的表达变化情况。

Inhibitory effect of arsenite on human lung adenocarcinoma cells in vitro

A method of inhibiting human lung adenocarcinoma cells by arsenite in vitro was studied. Human lung adenocarcinoma cells (LAC) were cultured in logarithmic phase. After 24 hours of culture, different concentrations of arsenite (0.75, 1.0, 1.5, 2.0 mg/L) were added to the cells. Cell morphology was observed by inverted phase contrast microscopy. Tetramethylazole salt (MTT) method was used to detect the growth of LAC cells. The expression of p53 gene was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

【技术实现步骤摘要】
一种亚砷酸对人肺腺癌细胞体外抑制的方法
本专利技术涉及一种亚砷酸对人肺腺癌细胞体外抑制的方法，具体地说是以一种亚砷酸对人肺腺癌细胞体外抑制的方法。
技术介绍
目前公知的中药砒霜（三氧化二砷，AS２Ｏ３）及砷制剂对肿瘤的治疗是近年来的研究热点，特别是对白血病的治疗已为人们所关注。砷作为抗肿瘤药物在我国已有百年历史，中药传统方剂青黄散、十味丸等治疗不同类型的白血病确有一定疗效，经鉴定其中有效成分为含砷中药。近年来的实验与临床研究发现，三氧化二砷对肺癌有良好的抗肿瘤作用，其作用机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡、抑制其增殖、逆转耐药等有关，但其治疗肺癌的确切机理未完全阐明。
技术实现思路
材料和方法1、细胞株、药物与试剂LAC细胞株由广州军区总医院分子肿瘤学研究所细胞室提供；亚砷酸注射液，批号：19990191，由哈尔滨伊达药业有限公司生产；胎牛血清（FSC）为中国医学科学院血液学研究所产品；RPMI1640培养基、乙二胺四乙酸（EDTA）、胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑盐（MTT）均为GIBCO公司产品；人p53定量酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司。2、细胞培养将冻存的LAC株按常规方法复苏，接种于RPMI1640培养液（含体积分数为10％FSC、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素）中，于37℃、体积分数为5%CO2浓度及饱和湿度的恒温培养箱中培养，细胞呈单层贴壁生长，每2～３d传代1次；传代时用0.25g／Ｌ的胰蛋白酶和0.2g／ＬＥＤＴＡ消化2～３min，以培养液吹打制成细胞悬液，接种至50mL培养瓶，至细胞生长旺盛后，取对数生长期细胞用于实验。3、细胞形态观察选用对数生长期细胞，用胰蛋白酶消化后，采用培养细胞计数法，用1640液稀释成2×105/mL浓度的细胞悬液接种至50mL培养瓶；置于37℃、体积分数为5％CO2及饱和温度的恒温培养箱中培养24h后，实验组分别加入各种浓度（0.75、1.0、1.5、2.0mg/L）的亚砷酸，模型组则加入不含药的细胞培养液。置于CO2培养箱中培养48h、72h后，将培养瓶置于倒置相差显微镜下进行细胞生长状态的观察。4、MTT比色法检测LAC肿瘤细胞的生长抑制率选用对数生长期细胞，用胰蛋白酶消化后，采用培养细胞计数法，用RPMI1640培养液稀释配成1×105个/mL的细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔接种100μL，在ＣＯ２培养箱中培养24h后，实验组加入不同浓度的亚砷酸（0.75、1.0、1.5、2.0mg/L）100μL，模型对照组则换含等体积溶剂的培养基，每组设16孔；每日更换新鲜培养液，以维持亚砷酸药液浓度不变；在ＣＯ２培养箱中培养24、48、72h后每孔加入20μLMTT无血清培养基，37℃继续培养4h后，每孔加入100μLDMSO，振荡混匀后，在酶标仪上检测492nm处各孔吸光度（Ｄ）值，计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：p抑制／%＝（1－Ｄ实验组／Ｄ模型组）×100％。人p53基因的检测选用对数生长期细胞，用胰蛋白酶消化后，采用培养细胞计数法，用1640培养液稀释成2×105/mL浓度的细胞悬液接种至50mL培养瓶中；在ＣＯ2培养箱中培养24h后，实验组分别加入各种浓度（0.75、1.0、1.5、2.0mg/L）的亚砷酸，模型对照组则加入不含药的细胞培养液；置ＣＯ２培养箱中培养48h后收集细胞，过滤后离心，吸取细胞培养上清液用于实验。按p53ELISA试剂盒操作要求，依次加样、洗涤、孵育、洗涤，于酶标仪492nm波长处比色。测定样品的吸光度值。统计学方法数据采用SPSS100软件包处理。结果：各浓度亚砷酸均能使LAC细胞发生凋亡特征性形态改变，能显著性抑制LAC株的增殖，且呈现一定的时间效应关系，并能显著性升高p53基因的含量（均Ｐ＜0.0５或Ｐ＜0.0１）。专利技术目的：中药砒霜（三氧化二砷，AS２Ｏ３）及砷制剂对肿瘤的治疗是近年来的研究热点，特别是对白血病的治疗已为人们所关注。砷作为抗肿瘤药物在我国已有百年历史，中药传统方剂青黄散、十味丸等治疗不同类型的白血病确有一定疗效，经鉴定其中有效成分为含砷中药。近年来的实验与临床研究发现，三氧化二砷对肺癌有良好的抗肿瘤作用，其作用机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡、抑制其增殖、逆转耐药等有关，但其治疗肺癌的确切机理未完全阐明。近年来临床上将亚砷酸（化学成分：三氧化二砷）用于治疗肺癌已取得一定的效果，故本专利技术试图通过体外培养人肺腺癌细胞株（LAC）作为研究对象，观察亚砷酸对LAC细胞形态及p53基因表达的影响，以了解亚砷酸用于治疗肿瘤的机理。技术方案：以体外培养的人肺腺癌细胞株（LAC）细胞为研究对象，选用对数生长期细胞，培养24h后，分别加入不同浓度的亚砷酸（0.75、1.0、1.5、2.0mg/L)，并设模型对照组；采用倒置相差显微镜观察细胞形态，四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测LAC细胞的生长抑制率；酶联免疫吸附（ELISA）法检测p53基因的表达变化情况。专利技术有益效果：亚砷酸抗肺癌的作用可能是通过上调p53基因的表达来诱导LAC肿瘤细胞凋亡，从而抑制LAC细胞的增殖，这可能也是中药砒霜能治疗肿瘤的机理之一。最佳实施方式：运用药物治疗。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种亚砷酸对人肺腺癌细胞体外抑制的方法，选用对数生长期细胞，培养24h后，分别加入不同浓度的亚砷酸（0.75、1.0、1.5、2.0mg/L)，采用倒置相差显微镜观察细胞形态，四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测LAC细胞的生长抑制率；酶联免疫吸附（ELISA）法检测p53基因的表达变化情况。

【技术特征摘要】
1.一种亚砷酸对人肺腺癌细胞体外抑制的方法，选用对数生长期细胞，培养24h后，分别加入不同浓度的亚砷酸（0.75、1.0、1.5、2.0mg/L)，采用倒置相差显微镜观察细胞形态，四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测LAC细胞的生长抑制率；酶联...

【专利技术属性】
技术研发人员：王燕侠，
申请(专利权)人：王燕侠，
类型：发明
国别省市：甘肃,62