The present invention provides a nuclease with endonuclease activity guided by phosphorylated small DNA. The nuclease with PIWI domain plays a specific role in cutting RNA. Although PIWI from thermophilic bacteria can cut double strands of DNA, it needs more than 65 degrees Celsius to work. The PIWI discovered by the invention can cut DNA double strands under mild conditions at 37 ~C, thereby facilitating the operation of genetic engineering.
【技术实现步骤摘要】
受核苷酸片段引导具有特异核酸内切酶活性的PIWI蛋白
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种受磷酸化核苷酸片段(DNA/RNA)引导具有核酸内切酶活性的PIWI蛋白。
技术介绍
PIWI结构域是Argonaute蛋白的组成部分，通常位于Argonaute蛋白的C末端。PIWI家族包含一个保守结构，由位于中间的PAZ结构域和位于C末端的PIWI结构域组成。PIWI结构域有一个的类似RNaseH的折叠结构，包含具有催化活性的四聚体Asp-Glu-Asp-X(X代表Asp，或Asn，或His)。Ago蛋白与核苷酸的作用主要依赖PIWI上的氨基酸残基与发挥引导作用的DNA/RNA的磷酸二酯碱结合，对目标链进行剪切。在有些Argonaute蛋白中，PIWI中具有剪切活性的氨基酸发生突变，导致Argonaute蛋白内切核酸酶活性缺失。目前所报道的PIWI结构域基本只作用于RNA，作用于DNA的报道仅有来自嗜热菌的Argonaute蛋白，在75℃作用下才能对DNA发生剪切作用。而本专利技术所提供的PIWI结构域，在37℃能够对DNA发生剪切作用，且受到磷酸化小DNA的引导...
【技术保护点】
1.一种具有PIWI结构域的核酸酶，其特征在于，所述的核酸酶包含有：1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的核酸酶2)任何含有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽片段或其变体，其具有与1)中核酸酶相似或相同的活性。
【技术特征摘要】
1.一种具有PIWI结构域的核酸酶，其特征在于，所述的核酸酶包含有：1)氨基酸序列为SEQIDNO:1的核酸酶2)任何含有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的多肽片段或其变体，其具有与1)中核酸酶相似或相同的活性。2.权利要求1所述的具有PIWI结构域的核酸酶在受磷酸化的小DNA/RNA引导下作为核酸内切酶剪切核酸的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的核酸为超螺旋DNA，线性双链DNA，线性单链DNA，环状单链DNA中的任一种。4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的小DNA/RNA，其长度为10-40bp。5.如权利要求2或4所述的应用，其特征在于，所述的小DNA/RNA是与剪切目标DNA链匹配的单链片段或双链片段。6.权利要求1所述的具有PIWI结构域的核酸酶的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下的步骤：1)构建定点切割核酸酶的重组表达质粒PCR扩增编码PIWI结构域的片段，获得编码PIWI结构域的基因，并将该基因克隆到原核表达载体pET28，构建PIWI结构域重组表达质粒；2)重组表达PIWI蛋白将构建的PIWI重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，得到PIWI蛋白重组表达菌株，再将其用诱导剂IPTG进行诱导表达；3)亲和纯化表达的PIWI蛋白离心收集诱导表达PIWI的大肠杆菌...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑明刚，王玲，郑立，王闻，曲凌云，郑择芃，马粒雅，
申请(专利权)人：自然资源部第一海洋研究所，青岛大学，
类型：发明
国别省市：山东,37
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