一种烟草黄色土源菌及其分离方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种烟草黄色土源菌及其分离方法和应用，该细菌的微生物学分类命名为烟草黄色土源菌Flavisolibacter sp.X7X，已于2018年9月10日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC 16451。本发明专利技术从土壤中分离得到的烟草黄色土源菌X7X，可用于发酵制备生物香料。所述生物香料，加入到卷烟烟丝中能使卷烟具有特殊香气，进行卷烟抽吸，能丰富烟香，减少烟气青杂气，增加细腻性，降低刺激性，适合卷烟加香。

A Tobacco Yellow Soil-Origin Bacteria and Its Isolation Method and Application

The invention provides a tobacco yellow soil-derived bacteria and its isolation method and application. The microbiological classification of the bacteria is named Flavisolibacter sp. X7X, which has been preserved in the General Microbial Center of China Microbial Species Preservation and Management Committee on September 10, 2018, and the preservation number is CGMCC 16451. The tobacco yellow soil-derived bacterium X7X isolated from the soil of the invention can be used for fermentation to prepare biological spices. The biological flavor can make cigarettes have special aroma when added to the tobacco cut, and smoke cigarettes. It can enrich cigarettes, reduce smoke impurities, increase fineness and reduce irritation, and is suitable for cigarette flavoring.

【技术实现步骤摘要】
一种烟草黄色土源菌及其分离方法和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种烟草黄色土源菌及其分离方法和应用。
技术介绍
加香加料是卷烟工艺中的关键环节，是完善产品风格的决定性因素和提高卷烟香气质量的有效手段之一。目前，烟用香料按来源分为三类，即来自非烟草的天然植物香精油、浸膏等；来自非烟草的天然植物香料，如从各种植物的花、果实、根、茎、叶中提取的精油浸膏、酊剂等；人工合成的香料，如醇、醛、酮等单体香料。按香料生产方法的不同主要分为两种，即采用各种分离手段直接从烟草或其它植物中提取的天然香料和采用化学反应合成的香料。目前，这两种方法都有其优点，但均存在一定的局限性。如直接从植物中提取天然香料，虽然生产操作简单，但存在改善卷烟抽吸效果不明显等缺点；采用化学合成的香料，虽然生产过程易于控制，但也存在香气单调、不自然等缺点。近年来，随着微生物技术日新月异的发展，微生物法生产香料的工作已取得了很多进展。微生物种类丰富，长期以来人们利用纯培养技术对环境中的微生物进行调研和开发利用，微生物资源在科技研究及生物产业中的重要性也日益凸显。世界上许多国家都在搜集、保存各种微生物资源，微生物资源的不断丰富将为我国生物技术的发展奠定坚实的物质基础。利用微生物对香原料进行发酵，可以增加传统提取香原料中多种香气物质的含量，提升香气丰富性。产香微生物，即能够产生具有芳香气味物质的微生物。目前，已经得到应用的产香微生物主要包括生香活性干酵母(生香ADY)、假丝酵母、乳酸菌、黑曲霉等。但是应用到卷烟中的微生物还很少，而且增香效果也不太理想。
技术实现思路
*除非另有说明，本专利技术中所采用的百分数均为质量百分数。本专利技术第一方面涉及一种具有产香功能的微生物烟草黄色土源菌X7X，分离于采自昆明市一个烟草生产基地的烟草根际土样，对其进行了形态学、生理生化性质和16SrRNA测序分析，鉴定结果表明其属于黄色土源菌属，微生物学分类命名为烟草黄色土源菌Flavisolibactersp.X7X，已于2018年9月10日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC16451，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。本专利技术分离得到的烟草黄色土源菌X7X菌株的主要形态特征和生理生化性质特征为：该菌株的细胞为革兰氏阴性、需氧型，非运动的杆状结构。细胞大小为宽0.6-0.7um，长1.2-2.0um。在R2A琼脂平板培养基上，30℃培养7天后，菌落呈现黄色、表面光滑、中央凸起边缘整齐，直径为1.0-3.0mm的形状。菌株能够在20-40℃，pH为6.0-8.0的范围内生长，最适生长温度为30℃，最适pH值为7.0。菌株的明胶液化，氧化酶、过氧化氢酶，吐温40水解反应结果呈阳性，酪蛋白、纤维素、淀粉和吐温20、80水解结果呈阴性。菌株的碱性磷酸酶、脂酶C4、脂酶C8、亮氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、半胱氨酸芳胺酶，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、α-半乳糖苷酶、β-糖醛酸酶、酸性磷酸酶检测结果呈阳性，精氨酸双水解酶、柠檬酸的利用、吲哚反应、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、色氨酸脱氨酶检测结果呈阴性。本专利技术所分离得到的烟草黄色土源菌X7X菌株能够利用乙醛酸、D-阿拉伯醇、蚁酸、果糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、糖醛酸、D-乳酸甲酯、苹果酸和山梨醇作为碳源，但不能利用天冬氨酸、α-羟基丁酸、纤维二糖、果糖、半乳糖、蔗糖、鼠李糖和丝氨酸。所述X7X菌株细胞的极性主要包括磷脂酰乙醇胺、一个未鉴定的氨基磷脂、两个未鉴定的糖脂；主要的呼吸醌为MK-7；主要的脂肪酸为iso-C15:0，iso-C17:03OH和summedfeature3(C16:1ω7c和/或C16:1ω6c)。本专利技术所分离得到的烟草黄色土源菌X7X，其基因组的G+C含量为49.7％的，其16SrRNA基因核苷酸序列如序列表所示，该序列已递交国际核苷酸序列数据库(GenBank)，序列检索号：MG209702。本专利技术第二方面涉及一种分离、培养和鉴别如本专利技术第一方面所述的烟草黄色土源菌X7X的方法，包括以下步骤：a、从自然环境中取土壤样品，加无菌水稀释后并于R2A琼脂平板培养基上，采用平板划线法分离纯化菌株，编号后加入到甘油或涂布于R2A斜面培养基中，置于冰箱保藏备用；b、将步骤a分离得到的微生物菌株分别接种到R2A液体培养基后，震荡培养，制得各微生物菌株的种子液，观察种子液外观和香气特征变化，筛选出其中能产生特殊香气的微生物菌株；c、将步骤b筛选出的能产生特殊香气的微生物菌株，继续接种于R2A琼脂平板培养基上，进行化学和分子分析，构建系统发育树进行菌种鉴别。上述分离、培养和鉴别如本专利技术第一方面所述的烟草黄色土源菌X7X的方法，步骤a中的土壤样品取自云南省昆明市的烟草生产基地的烟草根际。上述分离、培养和鉴别如本专利技术第一方面所述的烟草黄色土源菌X7X的方法，步骤a具体为，称取10g土壤样品，加入100mL无菌水，30℃、200rpm震荡培养30min。用无菌水稀释至10-3、10-4w/v倍浓度，各取0.1mL均匀涂布于R2A琼脂平板上，放入30℃恒温培养箱中培养2周。在培养平板上挑取不同形态单菌落，继续采用平板划线法分离纯化菌株，编号后接种于R2A斜面培养基，或配制成甘油悬液(20％，w/v)，置于-80℃条件下保藏。上述分离、培养和鉴别如本专利技术第一方面所述的烟草黄色土源菌X7X的方法，步骤a和c中R2A琼脂平板培养基的组成如下：葡萄糖0.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，酸水解酪蛋白0.5g，可溶性淀粉0.5g，丙酮酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.05g，琼脂15g，蒸馏水定容到1000mL，pH7.2。上述分离、培养和鉴别如本专利技术第一方面所述的烟草黄色土源菌X7X的方法，步骤b中R2A液体培养基的组成如下：葡萄糖0.5g；酵母膏0.5g；蛋白胨0.5g；酸水解酪蛋白0.5g；可溶性淀粉0.5g；丙酮酸钠0.3g；磷酸氢二钾0.3g；硫酸镁0.05g；蒸馏水1000mL，pH7.2。上述分离、培养和鉴别如本专利技术第一方面所述的烟草黄色土源菌X7X的方法，步骤b中振荡培养温度为30℃，振荡速度160rpm，培养至菌液浓度为光密度OD＝1.5；步骤c中培养温度为30℃，培养7天。本专利技术第三方面涉及一种利用本专利技术第一方面所述的烟草黄色土源菌X7X发酵制备生物香料的方法，其特征在于，包括如下步骤：将烟草黄色土源菌X7X液体菌种按10％的接种量接种到发酵培养基中进行扩大培养，30℃下摇瓶培养7天，用石油醚萃取3次，合并萃取液，萃取液进行浓缩，经无水硫酸钠干燥后，所得淡褐色液体，即为生物香料。上述利用本专利技术第一方面所述的烟草黄色土源菌X7X制备生物香料的方法，发酵培养基的组成如下：黄豆饼浸出汁10mL，葡萄糖10g，蛋白胨3g，氯化钠2.5g，碳酸钙2g，蒸馏水1000mL，PH7.2。本专利技术具有以下有益效果：(1)本专利技术首次从云南省昆明市的烟草生产基地的烟草根际土样中分离得到新的具有产香功能的试验菌种X7X，经形态学、生理生化性质和16SrRNA测序分析表明该菌株是一种新的细菌，微生物学分类命名为烟草黄色土源菌Flavisolibacte本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种烟草黄色土源菌，其特征在于，其微生物学分类命名为烟草黄色土源菌Flavisolibacter sp.X7X，已于2018年9月10日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC 16451。

【技术特征摘要】
1.一种烟草黄色土源菌，其特征在于，其微生物学分类命名为烟草黄色土源菌Flavisolibactersp.X7X，已于2018年9月10日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC16451。2.一种分离、培养和鉴别权利要求1所述的烟草黄色土源菌X7X的方法，其特征在于，包括以下步骤：a、从自然环境中取土壤样品，加无菌水稀释后并于R2A琼脂平板培养基上，采用平板划线法分离纯化菌株，编号后加入到甘油或涂布于R2A斜面培养基中，置于冰箱保藏备用；b、将步骤a分离得到的微生物菌株分别接种到R2A液体培养基后，震荡培养，制得各微生物菌株的种子液，观察种子液外观和香气特征变化，筛选出其中能产生特殊香气的微生物菌株；c、将步骤b筛选出的能产生特殊香气的微生物菌株，继续接种于R2A琼脂平板培养基上，进行化学和分子分析，构建系统发育树进行菌种鉴别。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤a和c中R2A琼脂平板培养基的组成如下：葡萄糖0.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，...

【专利技术属性】
技术研发人员：高莉，段焰青，李源栋，者为，王坚，李文均，陈兴，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南,53