同时去除低温地下水中有机磷农药和硝酸盐的假单胞菌及其应用制造技术

同时去除低温地下水中有机磷农药和硝酸盐的假单胞菌及其应用，涉及微生物领域，尤其涉及一株假单胞菌。是要解决现有的清除地下水中污染物的微生物无法适应地下低温环境的问题。该好氧‑兼性自养假单胞菌为Pseudomonas extremaustralis Y39‑6，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年10月29日，保藏编号为CGMCC No.16652。该菌株可在好氧、无外加碳源的贫营养条件下，进行反硝化。同时，能够高效去除有机磷农药。本发明专利技术用于去除低温地下水中污染物。

Simultaneous removal of organophosphorus pesticides and nitrates from low-temperature groundwater by Pseudomonas spp. and its application

At the same time, the removal of organophosphorus pesticides and nitrates from low-temperature groundwater by Pseudomonas spp. and its application involve the field of microorganisms, especially a Pseudomonas spp. It is necessary to solve the problem that the existing microorganisms which remove pollutants from groundwater can not adapt to the underground low temperature environment. The aerobic facultative autotrophic Pseudomonas extremaustralis Y39 6 is stored in the General Microbial Center of China Microbial Species Preservation and Management Committee. The date of storage is October 29, 2018, and the number of storage is CGMCC No. 16652. The strain can denitrify under aerobic and non-nutritious conditions without additional carbon source. At the same time, it can remove organophosphorus pesticides efficiently. The invention is used for removing pollutants in low temperature groundwater.

【技术实现步骤摘要】
同时去除低温地下水中有机磷农药和硝酸盐的假单胞菌及其应用
本专利技术涉及微生物领域，尤其涉及一株假单胞菌。
技术介绍
地下水是我国居民的生活用水主要来源之一。由于农业经济发展、农业化肥的大量施用，使部分地区的地下水中硝酸盐浓度过高，超过国家《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)规定的10mg/L。如果饮用水中含有过量的硝酸盐容易引起高铁血红蛋白症，甚至会诱发癌症，对人体造成危害。由于农药的普遍使用，地下水存在受农药污染的风险。有机磷农药(organophosphorouspesticides，OPPs)中有一些种类属于高毒性有机污染物，需要严格控制，在我国《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)中明确规定了有机磷类农药(如乐果、对硫磷、甲基对硫磷、毒死蜱、草甘膦、敌敌畏等)的限值。通过微生物的作用，清除地下水中污染物，或使污染物无害化的过程称为生物修复过程。相比物理化学方法而言，生物修复作用具有成本低、已操作、二次污染风险小的优点。但由于地下水(尤其是我国北方地下水)水温常年低于10℃，通常为6～8℃，低温影响了微生物的生命活动。而且，地下水中缺少可生物利用碳源，因此限制了反硝化细菌的应用。
技术实现思路
本专利技术是要解决现有的清除地下水中污染物的微生物无法适应地下低温环境的问题，提供一株同时去除低温地下水中有机磷农药和硝酸盐的假单胞菌及其应用。本专利技术同时去除低温地下水中有机磷农药和硝酸盐的假单胞菌为PseudomonasextremaustralisY39-6，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年10月29日，保藏编号为CGMCCNo.16652。本专利技术PseudomonasextremaustralisY39-6为专性好氧菌，革兰氏染色阴性，菌落凸起，粘稠，呈乳白色；接触酶和氧化酶阳性，生长温度4～37℃，最适pH值为7.5～8.0。本专利技术PseudomonasextremaustralisY39-6不产生吲哚，不能水解葡萄糖，不能液化明胶，不能水解淀粉、酪蛋白；缺少尿素酶和β-半乳糖苷酶；可以利用D-葡萄糖、L-树胶醛糖、D-甘露醇、葡萄糖酸钾、甘油、葵酸、己二酸、羟基丁二酸、柠檬酸三钠、苯基丙氨酸、乙酸、乙醇、丁酸、葡萄糖作为唯一碳源。本专利技术PseudomonasextremaustralisY39-6通过16SrDNA序列比对分析，与模式菌株Pseudomonasextremaustralis14-3T的相似性为99.85％。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定，本专利技术的菌株Y39-6属于Pseudomonasextremaustralis。本专利技术的假单胞菌在去除低温地下水中污染物的应用。进一步的，所述低温地下水为6～10℃的地下水。进一步的，所述污染物为有机磷农药和硝酸盐。进一步的，所述有机磷农药为乐果、对硫磷、甲基对硫磷、毒死蜱和草甘膦。本专利技术PseudomonasextremaustralisY39-6可在好氧、无外加碳源的贫营养条件下，进行反硝化。同时，能够高效去除有机磷农药。在6～10℃条件下、进水硝酸盐浓度为100mg/L、进水乐果、对硫磷、甲基对硫磷、毒死蜱和草甘膦浓度分别均为0.5mg/L的条件下，PseudomonasextremaustralisY39-6可去除水中90％以上的硝酸盐和99％的有机磷农药。本专利技术PseudomonasextremaustralisY39-6，属于Pseudomonasextremaustralis，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年10月29日，保藏编号为CGMCCNo.16652。附图说明图1为本专利技术PseudomonasextremaustralisY39-6的革兰氏染色结果；图2为本专利技术PseudomonasextremaustralisY39-6的菌落照片。具体实施方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一：本实施方式同时去除低温地下水中有机磷农药和硝酸盐的假单胞菌为PseudomonasextremaustralisY39-6，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年10月29日，保藏编号为CGMCCNo.16652。本实施方式PseudomonasextremaustralisY39-6为专性好氧菌，革兰氏染色阴性(如图1所示)，菌落凸起，粘稠，呈乳白色(如图2所示)；接触酶和氧化酶阳性，生长温度4～37℃，最适pH值为7.5～8.0。参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》对本实施方式PseudomonasextremaustralisY39-6进行生理生化鉴定：本实施方式PseudomonasextremaustralisY39-6不产生吲哚，不能水解葡萄糖，不能液化明胶，不能水解淀粉、酪蛋白；缺少尿素酶和β-半乳糖苷酶；可以利用D-葡萄糖、L-树胶醛糖、D-甘露醇、葡萄糖酸钾、甘油、葵酸、己二酸、羟基丁二酸、柠檬酸三钠、苯基丙氨酸、乙酸、乙醇、丁酸、葡萄糖作为唯一碳源。具体实施方式二：本实施方式PseudomonasextremaustralisY39-6的获取方法为：取受硝酸盐污染(硝酸盐浓度140mg/L)的低温地下水(水温4℃)100ml，在2～6℃、150rpm/min下富集12～20d，期间不断补充NaNO3，待菌液的OD600值达到0.5以上后，梯度稀释并接种于固体培养基上，在2～6℃下培养5～7d，选取典型的单一菌落进行纯化培养。将最终获得的纯培养菌株进行硝酸盐还原试验，选取30min内对硝酸盐还原率达到70％以上的菌株，之后用分别加入0.5mg/L的乐果、对硫磷、甲基对硫磷、毒死蜱和草甘膦，对菌株进行驯化，选取能在驯化过程中存活下来的菌株，并测定菌株对乐果、对硫磷、甲基对硫磷、毒死蜱和草甘膦的去除率，选取去除率高于90％的菌株，即为本实施方式的PseudomonasextremaustralisY39-6。所述固体培养基为：NaNO30.1～0.5g/L，MnSO40.01～0.05g/L，(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O0.01～0.10g/L，CaCl20.01～0.05g/L，Na2HPO40.3～0.9g/L，MgSO4·7H2O0.01～0.05g/L，NaCl0.3～0.9g/L，琼脂1.8g/L，pH值7.0～7.4。对PseudomonasextremaustralisY39-6进行分子鉴定，提取菌株的总DNA，采用细菌的16SrDNA通用引物，正向引物5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’；反向引物5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系如下：20～50ng模板DNA，0.2μLTaq酶，2.5μL10×Buffer(含Mg2+)，1μLdN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.同时去除低温地下水中有机磷农药和硝酸盐的假单胞菌，其特征在于该菌株为Pseudomonas extremaustralis Y39‑6，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年10月29日，保藏编号为CGMCC No.16652。

【技术特征摘要】
1.同时去除低温地下水中有机磷农药和硝酸盐的假单胞菌，其特征在于该菌株为PseudomonasextremaustralisY39-6，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年10月29日，保藏编号为CGMCCNo.16652。2...

【专利技术属性】
技术研发人员：张多英，赵文军，吴淼男，张彦龙，白也，刘红，
申请(专利权)人：黑龙江大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23