特异性结合至CD3和CD123的双特异性抗体样结合蛋白制造技术

本发明专利技术涉及特异性结合至CD3和CD123的抗体样结合蛋白。本发明专利技术还涉及包含所述抗体样结合蛋白的药物组合物及所述药物组合物和抗体样结合蛋白用于治疗癌症的用途。本发明专利技术进一步涉及包含编码所述抗体样结合蛋白的序列的分离的核酸、载体和宿主细胞。

Bispecific antibody-like binding proteins binding specifically to CD3 and CD123

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】特异性结合至CD3和CD123的双特异性抗体样结合蛋白本专利技术涉及特异性结合至CD3和CD123的抗体样结合蛋白。本专利技术还涉及包含所述抗体样结合蛋白的药物组合物以及所述药物组合物和抗体样结合蛋白用于治疗癌症的用途。本专利技术还涉及包含编码所述抗体样结合蛋白的序列的分离的核酸、载体和宿主细胞。第一代双特异性抗体是在20多年前开发的。此后，一些临床研究已经测试了针对靶向癌细胞表面抗原而设计的双特异性抗体。这组抗癌融合蛋白含有两个或更多个功能域，其将靶向的癌细胞附近的免疫效应细胞局部定位以达到抗癌活性。随着双特异性抗体技术的发展，通过仅用柔性接头(不包括Fc氨基酸片段)连接两个抗体单链可变区(scFv)来产生不同的一类融合蛋白，称为双特异性T细胞衔接体(BiTE)，一个scFv结合靶向的细胞，另一个则结合T细胞表面上的CD3。一种具有CD19xCD3双特异性结合活性的BiTE，博纳吐单抗(blinatumomab)在针对具有B系急性淋巴母细胞中的微小残留病的患者的II期临床试验中显示出有希望的结果。CD123(白细胞介素-3受体α链IL-3Rα)是在多种血液肿瘤中过度表达的肿瘤抗原。大多数AML细胞表达表面CD123，并且该表达不随AML的亚型变化。据报道，在诊断时CD123在AML中的较高表达与较差的预后相关。已经报道CD123在白血病干细胞(LSC)上表达。越来越多的证据表明，AML是由这些白血病干细胞(LSC)产生的，这些白细胞干细胞已被证明是静止的，并且对DNA损伤化学疗法是相对抗性的。因此，与造血干细胞(HSC)相比LSC上的CD123增加的表达提供了AML-LSC的治疗性靶向的机会。已经显示针对CD123产生的单克隆抗体(MAb)7G3抑制白血病细胞系和原代细胞二者的IL-3介导的增殖和活化(美国专利No.6,177,078)。然而，靶向CD123是否可以在功能上损害AML-LSC仍然不清楚。如本专利技术人所示，使用CD123xCD3抗体样结合蛋白导致肿瘤细胞杀伤。已经在国际专利申请WO2013/173820中提出并描述了制备具有CD123xCD3双特异性结合活性的双特异性抗体样结合蛋白的想法。此外，基于来自MacroGenics的分子的CD123xCD3双重亲和性重定向(DART)双特异性抗体在2014年进入I期临床试验。然而，如本专利技术人所示，例如，在不存在靶细胞的情况下，基于来自MacroGenics的分子的CD123xCD3双重亲和性重定向(DART)双特异性抗体具有表达CD4+的T细胞的82％和表达CD8+的T细胞的83％的活化。T细胞不适当的活化可能导致严重的副作用，如细胞因子释放综合征。细胞因子释放综合征是指由活化的T细胞导致的细胞因子释放，其产生与严重感染中发现的那些类似的一类全身性炎症反应，并且特征为低血压、发热和寒颤。已经报道了由于细胞因子释放综合征导致的死亡，例如针对抗CD3抗体OKT3所报道的。抗CD3/抗CD123抗体样结合蛋白描述于专利申请PCT/EP2016/051386中，该专利申请在本专利申请的优先权日之时尚未公布(根据欧洲专利公约第54(3)条)。因此，尽管在双特异性抗体技术方面取得了进步，但是仍然需要另外的癌症治疗剂，特别是直接或间接有效靶向和杀死癌细胞的癌症治疗剂。此外，需要开发具有期望的生物活性、良好的代谢、药代动力学和安全性概貌的新的抗CD3/抗CD123抗体样结合蛋白，并且还可以与工业实践相容地大规模生产。因此，在本专利技术的上下文中，专利技术人成功地开发了包含突变(例如RF突变和节-入-穴(Knob-into-hole)突变)的抗CD3/抗CD123抗体样结合蛋白的几种变体，从而降低所述抗CD3/抗CD123抗体样结合蛋白在表达过程中的聚集。通过减少聚集体的量，可以实现表达和纯化过程中抗体样结合蛋白的异二聚体的量的增加，从而提高纯化的抗CD3/抗CD123抗体样结合蛋白的产率。因此，本专利技术涉及包含导致在表达和/或纯化过程中聚集减少的突变的抗CD3/抗CD123抗体样结合蛋白。所述抗CD3/抗CD123抗体样结合蛋白在不存在表达CD123的靶细胞例如THP-1细胞的情况下具有低的T细胞活化能力，但是在存在表达CD123的靶细胞例如THP-1细胞的情况下具有高的T细胞活化能力。抗CD3抗体“CD3”表示作为多分子T细胞受体复合物的一部分的T细胞上表达的抗原，所述抗原由至少三种不同的链CD3ε，CD3δ和CD3γ组成。CD3δ和CD3γ与人CD3ε具有低序列同一性和/或相似性(相似性和同一性小于20％)。CD3ε和CDR3δ可以一起形成复合物，即所谓的“CD3ε/δ复合物”。CD3ε也与CDR3γ形成复合物，即所谓的“CD3ε/γ复合物”。T细胞上的CD3聚簇(例如通过固定的抗CD3抗体)导致T细胞活化，其类似于T细胞受体参与，但独立于其克隆典型特异性。“CD3ε”包含三个结构域，胞内结构域、跨膜结构域和胞外结构域。大多数现有技术的抗CD3抗体识别CD3ε链。这种现有技术的抗CD3抗体之一是OKT3。现有技术例如使用抗体分子OKT3来例示了使用抗体分子的T细胞活化事件。抗CD3抗体及其变体已经在现有技术(US4,361,549；US4,361,549；US5,885,573；US5,929,212；和WO98/52975或US5,955,358)中有描述。OKT3已被进一步用作临床移植治疗同种异体移植排斥反应的有效免疫抑制剂(Thistlethwaite1984,Transplantation38,695-701；Woodle1991,Transplantation51,1207-1212；Choi2001,Eur.J.Immunol.31(1),94-106)。该疗法的主要缺点是由于T细胞与携带FcγR的细胞和人抗小鼠抗体(HAMA)反应之间的交联而在细胞因子释放中表现出T细胞活化。几篇出版物已经描述了改变，例如OKT3的人源化，以减少这些副作用：US5,929,212；US5,885,573等。另一方面，OKT3或其他抗CD3抗体可用作免疫增强剂以刺激T细胞活化和增殖(US6,406,696Bluestone；US6,143,297Bluestone；US6,113,901Bluestone；Yannelly1990,J.Immunol.Meth.1,91-100)。抗CD3抗体也被描述为与抗CD28抗体组合用于诱导T细胞增殖的试剂(US6,352,694)。OKT3本身或作为靶向细胞毒性T细胞到肿瘤细胞或病毒感染细胞的双特异性抗体的组分进一步使用(Nitta1990,Lancet335,368-376；Sanna1995,Bio/Technology13,1221-1224；WO99/54440)。迄今为止使用抗体作为招募T细胞的药物的方法受到若干发现的阻碍。首先，对T细胞具有高结合亲和力的天然或工程化抗体通常不会激活它们所结合的T细胞。第二，与T细胞结合亲和力低的天然或工程化抗体在引发T细胞介导的细胞裂解的能力方面往往是无效的。包括信号肽的全长人CD3ε蛋白的参考序列可从Uniprot数据库获得，登录号为P07766(2014年12月12日可获得)，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗体样结合蛋白，其特异性结合人CD3ε和人CD123，其包含形成2个抗原结合位点的2条多肽链，其中一条多肽链具有如式[IV]所示的结构：VD1‑L1‑VD2‑L2‑CL‑L5‑Fc2            [IV]且一条多肽链具有如式[III]所示的结构：VD3‑L3‑VD4‑L4‑CH1‑Fc              [III]其中：a)所述式[IV]的多肽由如下组成：(i)氨基酸序列SEQ ID NO:71，其包含如下：·序列SEQ ID NO:54的VD1，·序列SEQ ID NO:56的L1，·序列SEQ ID NO:10的VD2，·序列SEQ ID NO:56的L2，·序列SEQ ID NO:18的CL，·L5由0个氨基酸组成，且·Fc2由序列SEQ ID NO:70组成·其中X1是Y，X2是S，X3是T，X4是L，X5是Y且X6是H且X7是Y，或·其中X1是Y，X2是C，X3是W，X4是L，X5是Y且X6是H且X7是Y，或·其中X1是Y，X2是C，X3是W，X4是L，X5是Y且X6是R且X7是F，或(iii)与SEQ ID NO:71至少85％相同的序列，其中·序列SEQ ID NO:54的VD1的序列SEQ ID NO:48，‘WAS’和SEQ ID NO:49的3个CDR是不变的，且·序列SEQ ID NO:10的VD2的序列SEQ ID NO:11，‘KVS’和SEQ ID NO:8的3个CDR是不变的，且·SEQ ID NO:71中的氨基酸X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7如上述a)(i)中定义；b)所述式[III]的多肽由如下组成：(i)氨基酸序列SEQ ID NO:67，其包含：·序列SEQ ID NO:9的VD3，·由0个氨基酸组成的L3，·序列SEQ ID NO:52的VD4，·由0个氨基酸组成的L4，·序列SEQ ID NO:19的CH1，和·由序列SEQ ID NO:68组成的Fc，其中X1是Y或C，X2是S或C，X3是T，S或W，X4是A或L，X5是V或Y，X6是H或R，且X7是Y或F，或(iii)与SEQ ID NO:67至少85％相同的序列，其中·序列SEQ ID NO:52的VD4的序列SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:53，和SEQ ID NO:51的3个CDR是不变的，且·序列SEQ ID NO:9的VD3的序列SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，和SEQ ID NO:7的3个CDR是不变的，且·SEQ ID NO:67的氨基酸X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7如上述b)(i)中定义，且其中式[IV]的多肽和式[III]的多肽形成交叉轻链‑重链对。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.07.18 EP 16305923.11.一种抗体样结合蛋白，其特异性结合人CD3ε和人CD123，其包含形成2个抗原结合位点的2条多肽链，其中一条多肽链具有如式[IV]所示的结构：VD1-L1-VD2-L2-CL-L5-Fc2[IV]且一条多肽链具有如式[III]所示的结构：VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc[III]其中：a)所述式[IV]的多肽由如下组成：(i)氨基酸序列SEQIDNO:71，其包含如下：·序列SEQIDNO:54的VD1，·序列SEQIDNO:56的L1，·序列SEQIDNO:10的VD2，·序列SEQIDNO:56的L2，·序列SEQIDNO:18的CL，·L5由0个氨基酸组成，且·Fc2由序列SEQIDNO:70组成·其中X1是Y，X2是S，X3是T，X4是L，X5是Y且X6是H且X7是Y，或·其中X1是Y，X2是C，X3是W，X4是L，X5是Y且X6是H且X7是Y，或·其中X1是Y，X2是C，X3是W，X4是L，X5是Y且X6是R且X7是F，或(iii)与SEQIDNO:71至少85％相同的序列，其中·序列SEQIDNO:54的VD1的序列SEQIDNO:48，‘WAS’和SEQIDNO:49的3个CDR是不变的，且·序列SEQIDNO:10的VD2的序列SEQIDNO:11，‘KVS’和SEQIDNO:8的3个CDR是不变的，且·SEQIDNO:71中的氨基酸X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7如上述a)(i)中定义；b)所述式[III]的多肽由如下组成：(i)氨基酸序列SEQIDNO:67，其包含：·序列SEQIDNO:9的VD3，·由0个氨基酸组成的L3，·序列SEQIDNO:52的VD4，·由0个氨基酸组成的L4，·序列SEQIDNO:19的CH1，和·由序列SEQIDNO:68组成的Fc，其中X1是Y或C，X2是S或C，X3是T，S或W，X4是A或L，X5是V或Y，X6是H或R，且X7是Y或F，或(iii)与SEQIDNO:67至少85％相同的序列，其中·序列SEQIDNO:52的VD4的序列SEQIDNO:50，SEQIDNO:53，和SEQIDNO:51的3个CDR是不变的，且·序列SEQIDNO:9的VD3的序列SEQIDNO:5，SEQIDNO:6，和SEQIDNO:7的3个CDR是不变的，且·SEQIDNO:67的氨基酸X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7如上述b)(i)中定义，且其中式[IV]的多肽和式[III]的多肽形成交叉轻链-重链对。2.根据权利要求1的抗体样结合蛋白，其中所述式[III]的多肽包含序列SEQIDNO:68的Fc，其中X1是Y，X2是S，X3是T，X4是L，X5是Y，或X1是C，X2是S，X3是S，X4是A，X5是V，且X6是H且X7是Y，或X6是R且X7是F。3.根据权利要求1或2的抗体样结合蛋白，其中a)所述式[IV]的多肽包含SEQIDNO:81的Fc域(Fc2)或与SEQIDNO:81至少85％相同的序列，且所述式[III]的多肽包含SEQIDNO:60的Fc域或与SEQIDNO:60至少85％相同的序列，或b)所述式[IV]的多肽包含SEQIDNO:73的Fc域(Fc2)或与SEQIDNO:73至少85％相同的序列，且所述式[III]的多肽包含SEQIDNO:75的Fc域或与SEQIDNO:75至少85％相同的序列，或c)所述式[IV]的多肽包含SEQIDNO:77的Fc域(Fc2)或与SEQIDNO:77至少85％相同的序列，且所述式[III]的多肽包含SEQIDNO:75的Fc域或与SEQIDNO:75至少85％相同的序列，或d)所述式[IV]的多肽包含SEQIDNO:77的Fc域(Fc2)或与SEQIDNO:77至少85％相同的序列，且所述式[III]的多肽包含SEQIDNO:79的Fc域或与SEQIDNO:79至少85％相同的序列。4.根据权利要求1或2的抗体样结合蛋白，其中a)一个式[IV]的多肽由如下氨基酸序列组成：SEQIDNO:80，或与SEQIDNO:80至少85％相同的序列，其中序列SEQIDNO:54的VD1的序列SEQIDNO:48，‘WAS’和SEQIDNO:49的3个CDR，以及序列SEQIDNO:10的VD2的序列SEQIDNO:11，‘KVS’和SEQIDNO:8的3个CDR及SEQIDNO:80的氨基酸位置481、486、498、500、539、567、568是不变的；且一个式[III]的多肽由如下氨基酸序列组成：SEQIDNO:59，或与SEQIDNO:59至少85％相同的序列，其中序列SEQIDNO:52的VD4的序列SEQIDNO:50，SEQIDNO:53，和SEQIDNO:51的3个CDR，以及序列SEQIDNO:9的VD3的序列SEQIDNO:5，SEQIDNO:6，和SEQIDNO:7的3个CDR及SEQIDNO:59的氨基酸位置473、492、531、559、560、478、490是不变的；或b)一个式[IV]的多肽由如下氨基酸序列组成：氨基酸序列SEQIDNO:72，或与SEQIDNO:72至少85％相同的序列，其中序列SEQIDNO:54的VD1的序列SEQIDNO:48，‘WAS’和SEQIDNO:49的3个CDR，以及序列SEQIDNO:10的VD2的序列SEQIDNO:11，‘KVS’和SEQIDNO:8的3个CDR及SEQIDNO:72的氨基酸位置481、486、498、500、539、567、568是不变的；且一个式[III]的多肽由如下氨基酸序列组成：SEQIDNO:74，或与SEQIDNO:74至少85％相同的序列，其中序列SEQIDNO:52的VD4的序列SEQIDNO:50，SEQIDNO:53，和SEQIDNO:51的3个CDR，以及序列SEQIDNO:9的VD3的序列SEQIDNO:5，SEQIDNO:6，和SEQIDNO:7的3个CDR及SEQIDNO:74的氨基酸位置473、492、531、559、560、478、490是不变的；或c)一个式[IV]的多肽由如下氨基酸序列组成：氨基酸序列SEQIDNO:76，或与SEQIDNO:76至少85...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·阿尔布雷赫特，C·拜尔，J·贝宁加，K·克罗尔，C·兰格，W·D·卢希纳，E·拉奥，M·施耐德，P·万内罗，S·格里夫，
申请(专利权)人：赛诺菲，
类型：发明
国别省市：法国,FR