一种大西洋鲑和虹鳟的质谱鉴别方法技术

本发明专利技术公开了一种大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，包括如下步骤：a)获取大西洋鲑的氨基酸序列；b)获取虹鳟的氨基酸序列；c)利用特异性的酶解方法将待检测蛋白质切成小分子量的多肽片段混合物，利用静电场轨道阱高分辨质谱全扫描模式检测混合物中各多肽的分子量和碎片信息，并与前面获取的氨基酸序列进行比对，定性判断是否存在大西洋鲑和虹鳟的特征肽段；d)挑选定性为大西洋鲑或虹鳟的特征肽段，利用串联四级杆质谱建立多反应监测方法进行定量分析。本发明专利技术利用蛋白质特征肽段鉴别，能够同时实现大西洋鲑和虹鳟的定性鉴定和掺假定量研究，最低检出限可达1％，灵敏度高，准确度高，抗干扰能力强，可广泛应用于大西洋鲑的真伪鉴别。

A Mass Spectrometric Identification Method for Atlantic Salmon and Rainbow Trout

The invention discloses a mass spectrometric identification method for Atlantic salmon and rainbow trout, which includes the following steps: a) acquiring amino acid sequence of Atlantic salmon; b) acquiring amino acid sequence of rainbow trout; c) using specific enzymatic hydrolysis method to cut the protein to be detected into a mixture of polypeptide fragments with small molecular weight, and using electrostatic field orbital trap high resolution mass spectrometry full scan mode to detect many of the mixture. The molecular weight and fragment information of the peptide were compared with the amino acid sequence obtained before, and the characteristic peptide segments of Atlantic salmon and rainbow trout were qualitatively judged; d) The characteristic peptide segments of Atlantic salmon or rainbow trout were selected and quantitatively analyzed by using tandem mass spectrometry. The method can simultaneously realize the qualitative identification and adulteration hypothesis research of Atlantic salmon and rainbow trout by using the protein characteristic peptide segment identification. The minimum detection limit can reach 1%. The method has high sensitivity, high accuracy and strong anti-interference ability, and can be widely used for authenticity identification of Atlantic salmon.

【技术实现步骤摘要】
一种大西洋鲑和虹鳟的质谱鉴别方法
本专利技术涉及一种蛋白质质谱检测方法，尤其涉及一种大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法。
技术介绍
海产品的真假和来源评估是食品评估鉴定中重要的组成部分。许多鱼类食品被标上错误标签，甚至有劣质鱼肉、假冒鱼肉被贴上优质鱼肉的标签，这严重影响了市场透明度，损害了消费者的健康。日前，中国水产流通与加工协会和三文鱼分会成员单位共同通过三文鱼的鉴定标准，将三文鱼定为鲑科鱼类的统称，大西洋鲑和虹鳟同为三文鱼的一种。这引发了业界的广泛关注和消费者的质疑。虽然大西洋鲑和虹鳟同属鲑科鱼类，但大西洋鲑是国际上流行的名贵食用鱼类，其含有2.7％的ω-3脂肪酸(EPA、DPA和DHA)，能有效的降低人体的胆固醇含量，从而预防心血管疾病的发生。大西洋鲑体内更富含抗氧化物质虾青素，虾青素在高温下极易氧化，只有生食才能保证大西洋鲑中的虾青素不被破坏，因此生食大西洋鲑一直是消费者热爱的食用方法。大西洋鲑多依赖进口，价格高昂，并且其肉色难辨，因此，国内市场上出现了以淡水虹鳟鱼冒充大西洋鲑的现象。许多消费者所认为的三文鱼是大西洋鲑这类的海水鱼而不是虹鳟这类的淡水鱼。虽然海水鱼和淡水鱼普遍都会携带有寄生虫，但其区别在于渗透压等因素。海水的渗透压高，与人类体内环境不同，因此海水鱼所携带的寄生虫多数情况下无法在人体内长时间存活及利用人体来完成生命周期。只要处理得当，生食海水鱼感染寄生虫的风险相对较低。而淡水鱼携带寄生虫成长环境与人体内环境类似，它们能在人体内长时间寄存且危害较大。我国内市场内大约有三分之一的“三文鱼”实际产自青藏高原等内陆淡水湖。商家为降低成本，以次充好，用国产虹鳟鱼冒充大西洋鲑的行为严重危害了消费着的健康。而此次中国水产协会将大西洋鲑和淡水虹鳟同定义为“三文鱼”的行为再次将三文鱼的鉴别引入公众视线。大西洋鲑和虹鳟鱼因为颜色和纹理较为相似，人类肉眼难以分辨。如何能确保消费者购买到的贵价三文鱼确实是大西洋鲑呢。目前，三文鱼的鉴别技术有近红外光谱技术和PCR-RFLP、AFLP、DNA条形码、荧光实时定量PCR等分子生物技术。PCR-RFLP和AFLP所用试剂对人体有害切操作步骤极为繁琐，用时较长。而荧光实时定量PCR鉴别物种虽然快速准确，但是成本较高。随着三文鱼销量的走高，进口三文鱼(大西洋鲑)的缺口进一步加大，利用虹鳟等淡水鱼冒充三文鱼的行为也逐渐增多。为保证消费者的知情权和身体健康，有必要一种新型的基于蛋白质组学的质谱检测方法，确定大西洋鲑和虹鳟的特征肽段，建立多反应监测方法进行定性和定量分析。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，灵敏度高，准确度高，抗干扰能力强，可广泛应用于大西洋鲑掺假的确证和检测。本专利技术为解决上述技术问题而采用的技术方案是提供一种大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，包括如下步骤：a)获取大西洋鲑和虹鳟的氨基酸序列并保存；b)利用特异性的酶解方法将待检测蛋白质切成小分子量的多肽片段混合物，利用静电场轨道阱高分辨质谱全扫描模式检测混合物中各多肽的分子量和碎片信息，并与步骤a)和b)中的氨基酸序列进行比对，实现蛋白质和多肽的鉴定；c)通过基本局部比对搜索工具与Uniprot数据库对比分析，筛选出大西洋鲑和虹鳟的特征肽段；d)利用三重四极杆质谱对大西洋鲑和虹鳟的特征肽段进行验证，并建立多反应监测方法进行掺假定量分析。上述的大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，其中，所述步骤a)从蛋白质数据库Uniport中下载获取大西洋鲑和虹鳟的氨基酸序列，所述步骤b)和c)通过质谱结果结合分析软件确定多肽片段混合物中是否存在大西洋鲑和虹鳟的特征肽段。上述的大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，其中，所述步骤b)利用胰蛋白酶进行酶解，酶解后的样品在HPLC-Q/Orbitrap上以数据依赖采集方式获得的全扫描质谱图进行蛋白质定性确证；所述步骤d)针对每个特征肽选择5-6个离子对进行多肽混合物的多反应监测，完成蛋白质定量检测。上述的大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，其中，所述步骤b)包括：b1)称取均质后的固体试样2g，加入2mL质量百分浓度0.1％的三氟乙酸溶液和8mL三氯甲烷溶液于50毫升离心管中，漩涡振荡器上涡旋震荡5min，进行氯仿脱脂，在4500r/min下离心3min，去除上清液，重复除脂2次，于室温减压浓缩至近干；b2)在样品中加入10mL摩尔浓度为50mmol/L三羟甲基氨基甲烷-酸盐溶液，调节控制pH值为7.2，漩涡振荡器上涡旋涡旋震荡1min，60℃水浴震荡提取1h，在10000r/min下离心5min，收集上清液备用；b3)移取200μL上述提取液于1.5mL低蛋白吸附的离心管中，加入150μL500mmol/L碳酸氢铵溶液，10μL摩尔浓度为500mmol/L二硫苏糖醇溶液，混匀后置75℃恒温水浴锅中孵育30min；b4)冷却至室温后，加入30μL500mmol/L碘代乙酰胺溶液，避光反应30min；b5)加入10μL摩尔浓度为100mmol/L氯化钙溶液和50μL牛胰蛋白酶溶液，充分混匀后置于37℃恒温水浴中过夜酶解；b6)加入10μL甲酸混匀，终止反应。上述的大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，其中，所述步骤d)蛋白质定量检测包括：选取不同类型、柱长或内径的色谱柱，记录色谱分离的变化；调节流动相流速、梯度或时间参数，记录分离效率的变化；控制柱温和试液温度，针对大西洋鲑和虹鳟的特征肽记录色谱保留时间的重现性；调节喷针位置、毛细管电压、锥孔电压、各路气体流量和温度以及碰撞能参数；采用全扫描方式观测蛋白酶解产物产生多电荷离子的排布与质量数范围。上述的大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，其中，还包括收集各种不同产地的大西洋鲑和虹鳟进行蛋白质特征肽定性确证和定量检测，并收集不同来源的样品，获取统计结果。上述的大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，其中，所述步骤c)中若检测出特征肽段GGLGSAGPTGPR、GEIGGVGANGPSGPQGGR、IGSGLVQEAAPLVDK或GDPGPGGPQGEPGAVGPAGITGDK，则定性判断混合物中存在大西洋鲑；所述步骤c)中若检测出特征肽段GDPGPGGPQGEQGVVGPAGISGDK，则定性判断混合物中存在虹鳟特征肽段。本专利技术对比现有技术有如下的有益效果：本专利技术提供的大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，能够定性确定大西洋鲑和虹鳟的特征肽段，并建立了大西洋鲑和虹鳟同时定性鉴定和精确测量的MRM方法，灵敏度高，检测限为1％；准确度高，抗干扰能力强，可广泛应用于大西洋鲑掺假的确证和检测。附图说明图1为本专利技术大西洋鲑和虹鳟特征肽段的质谱检测流程示意图；图2为本专利技术大西洋鲑特征肽段定量离子对和定性离子对的色谱质谱图；图3为本专利技术虹鳟定特征肽段定量离子对和定性离子对的色谱质谱图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步的描述。图1为本专利技术大西洋鲑和虹鳟特征肽段的质谱检测流程示意图。请参见图1，本专利技术采用的检测方法主要为液相色谱-质谱联用法，质谱联用电喷雾电离(ESI)是迄今为止最可靠的多肽检测技术。本专利技术提供的大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，包括如下步骤：S1)获取大西洋鲑和虹鳟的氨基酸序列并保存；S2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：a)获取大西洋鲑和虹鳟的氨基酸序列并保存；b)利用特异性的酶解方法将待检测蛋白质切成小分子量的多肽片段混合物，利用静电场轨道阱高分辨质谱全扫描模式检测混合物中各多肽的分子量和碎片信息，并与步骤a)和b)中的氨基酸序列进行比对，实现蛋白质和多肽的鉴定；c)通过基本局部比对搜索工具与Uniprot数据库对比分析，筛选出大西洋鲑和虹鳟的特征肽段；d)利用三重四极杆质谱对大西洋鲑和虹鳟的特征肽段进行验证，并建立多反应监测方法进行掺假定量分析。

【技术特征摘要】
1.一种大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：a)获取大西洋鲑和虹鳟的氨基酸序列并保存；b)利用特异性的酶解方法将待检测蛋白质切成小分子量的多肽片段混合物，利用静电场轨道阱高分辨质谱全扫描模式检测混合物中各多肽的分子量和碎片信息，并与步骤a)和b)中的氨基酸序列进行比对，实现蛋白质和多肽的鉴定；c)通过基本局部比对搜索工具与Uniprot数据库对比分析，筛选出大西洋鲑和虹鳟的特征肽段；d)利用三重四极杆质谱对大西洋鲑和虹鳟的特征肽段进行验证，并建立多反应监测方法进行掺假定量分析。2.如权利要求1所述大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，其特征在于，所述步骤a)从蛋白质数据库Uniport中下载获取大西洋鲑和虹鳟的氨基酸序列，所述步骤b)和c)通过质谱结果结合分析软件确定多肽片段混合物中是否存在大西洋鲑或虹鳟的特征肽段。3.如权利要求1所述的大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，其特征在于，所述步骤c)利用胰蛋白酶进行酶解，酶解后的样品在HPLC-Q/Orbitrap上以数据依赖采集方式获得的全扫描质谱图进行蛋白质定性确证；所述步骤d)针对每个特征肽选择5-6个离子对进行多肽混合物的多反应监测，完成蛋白质定量检测。4.如权利要求3所述的大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，其特征在于，所述步骤c)包括：c1)称取均质后的固体试样2g，加入2mL质量百分浓度为0.1％的三氟乙酸溶液和8mL三氯甲烷溶液于50毫升离心管中，漩涡振荡器上涡旋震荡5min，进行氯仿脱脂，在4500r/min下离心3min，去除上清液，重复除脂2次，于室温减压浓缩至近干；c2)在样品中加入10mL摩尔浓度为50mmol/L三羟甲基氨基甲烷-酸盐溶液，调节控制pH值为7.2，漩涡振荡器上涡旋涡旋震荡1min，60℃水...

【专利技术属性】
技术研发人员：古淑青，邓晓军，方真，赵超敏，陈念念，曲栗，韩丽，
申请(专利权)人：上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：上海,31