败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白、其类病毒颗粒及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白，其具有三个败血性巴氏杆菌毒素蛋白的抗原决定位。所述三个抗原决定位分别具有如SEQ ID NOs:2、3以及4所示的序列。本发明专利技术还提供一种含有所述败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒、编码所述败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白或编码所述含有所述败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒的核酸序列，以及含有所述败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白及/或所述含有所述败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒的猪萎缩性鼻炎免疫组合物。

【技术实现步骤摘要】
败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白、其类病毒颗粒及其应用
本专利技术关于败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白，特别是关于含有败血性巴氏杆菌毒素抗原决定位的重组蛋白，以及含有所述重组蛋白的类病毒颗粒。
技术介绍
猪萎缩性鼻炎(AtrophicRhinitis,AR)为猪只呼吸系统的三大主要传染病之一。猪萎缩性鼻炎会造成受感染的猪只的颜面骨畸形及慢性化脓性鼻炎，而引起鼻甲介骨的萎缩。在严重感染时，鼻腔、颔骨、上颔骨亦会发生病变。下鼻甲骨的下游窝状部位最常受感染。上鼻甲、下鼻甲骨、鼻中膈或筛骨等部位均会被感染。猪萎缩性鼻炎(AR)是由支气管败血性博德氏杆菌(Bordetellabronchiseptica,B.b)以及败血性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)A型菌(PmA)及D型菌(PmD)所引起，尤其是败血性巴氏杆菌D型菌(PmD)所产生的毒素(Pasteurellamultocidatoxin,PMT)。取PMT毒素分别以肌肉、腹腔及鼻腔接种等方式接种于四周龄小猪，均可以引致鼻甲介骨萎缩的病变产生，此外也会波及全身性骨骼发育而使生长迟缓，甚至高剂量接种时，会导致肝脏受损而造成猪只黄疸及死亡。猪萎缩性鼻炎(AR)遍及世界各养猪地区，患猪生长缓慢，饲料利用效率降低。单独感染时虽然死亡率不高，但污染率却很大，而且容易诱发其他合并症或病原的感染，造成高死亡率，增加生产成本。在猪萎缩性鼻炎(AR)严重感染的养猪场，其经济损失约为15-38％，且在重度感染的养猪场有较明显的生长障碍情形，平均日增重约较正常猪只少5-8％。因此开发有效的猪萎缩性鼻炎疫苗，以预防猪只罹患猪萎缩性鼻炎(AR)可以说是刻不容缓且极为重要的事。
技术实现思路
本专利技术在第一部分提供一种败血性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)毒素重组蛋白，包含：一具有如SEQIDNO:2所示氨基酸序列的败血性巴氏杆菌毒素蛋白的抗原决定位(epitopes)、一具有如SEQIDNO:3所示氨基酸序列的败血性巴氏杆菌毒素蛋白的抗原决定位，以及一具有如SEQIDNO:4所示氨基酸序列的败血性巴氏杆菌毒素蛋白的抗原决定位。本专利技术在第二部分提供一种含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(viruslikeparticle,VLP)，包含：一如前所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白以及一乙型肝炎病毒核心蛋白(HepatitisBviruscoreprotein,HBc)；其中所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白插入所述乙型肝炎病毒核心蛋白的主要免疫显性区域(Majorimmunodominantregion,MIR)。本专利技术在第三部分提供一种编码如前所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的核酸序列。本专利技术在第四部分提供一种编码如前所述的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒的核酸序列。本专利技术在第五部分提供一种猪萎缩性鼻炎免疫组合物，包含如前所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白以及如前所述的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒至少其中一种，以及一药学上可接受的载体。本专利技术在第六部分提供一种猪萎缩性鼻炎免疫组合物用于制备动物对抗猪萎缩性鼻炎的药物的应用。本专利技术在第七部分提供一种抗败血性巴氏杆菌D型菌毒素的抗体，是通过如前所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白或如前述的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒所制备而得。本专利技术在第八部分提供一种猪萎缩性鼻炎的检测试剂盒，包含一侦测单元，所述侦测单元选自于下列群组所组成中至少一者：一如前所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白、一如前所述的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒、一如前所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白所制备的抗体，以及一如前所述的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒所制备的抗体。本专利技术以下面的实施例及所附图式予以示范阐明，但本专利技术不受下述实施例所限制。附图说明图1所示为在一实施例中，含有本专利技术的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(VLP)的电子显微镜照片。箭头所指为本专利技术的一个类病毒颗粒。比例尺：50μm。图2所示为在一实施例中，以酵素连结免疫分析(ELISA)测定抗败血性巴氏杆菌毒素(PMT)抗体效价的结果；第1组为负对照组；第2组为含有实施例二所得的支气管败血性博德氏杆菌(B.b)、败血性巴氏杆菌A型菌(PmA)及败血性巴氏杆菌D型菌(PmD)的免疫组合物(B.b+PmA+PmD组)；第3组为实施例一所得的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmTVLP组)；第4组为实施例三所得的具有含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒的猪萎缩性鼻炎免疫组合物(B.b+PmA+PmD+re-PmTVLP组)；第5组为市售猪萎缩性鼻炎疫苗(市售疫苗组)。符号*与**代表与第1组(负对照组)相比具有显著差异(分别表示p<0.05与p<0.01)。符号#与##代表与第2组(B.b+PmA+PmD组)相比具有显著差异(分别表示p<0.05与p<0.01)。符号++代表与第5组(市售疫苗组)相比具有显著差异(表示p<0.01)。图3A至图3C所示为在一实施例中，中和抗体试验分析结果。图3A所示为以含有胎牛血清(FBS)的DMEM培养液培养Vero细胞的细胞形态(负对照组)；图3B所示为以含4倍最小毒性剂量(MTD)的败血性巴氏杆菌毒素(PMT)处理Vero细胞的细胞形态(正对照组)，可见到细胞呈现典型的结节样(如箭头所示)；图3C所示为以具有含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒的猪萎缩性鼻炎免疫组合物(B.b+PmA+PmD+re-PmTVLP组)免疫的小鼠血清稀释160倍后与4倍最小毒性剂量(MTD)的败血性巴氏杆菌毒素(PMT)中和后，加入Vero细胞共培养的细胞形态；图3D所示为以市售猪萎缩性鼻炎疫苗(市售疫苗组)免疫的小鼠血清稀释160倍后与4倍最小毒性剂量(MTD)的败血性巴氏杆菌毒素(PMT)中和后，加入Vero细胞共培养的细胞形态，依然可以见到细胞呈现典型的结节样(如箭头所示)。具体实施方式本专利技术提供一种败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(re-PmT)，包含三个败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PmT)的抗原决定位(epitopes)，以诱导动物产生抗败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PmT)的抗体。所述三个抗原决定位分别是：抗原决定位A:SVGKEGAYYPDHDYGPEYNPVWGPNEQI(SEQIDNO:2)；抗原决定位B:SISPDDPPREITD(SEQIDNO:3)；以及抗原决定位C:LNSTPGTGRPMP(SEQIDNO:4)。在某些优选的实施例中，各个所述的抗原决定位的氨基酸序列之间可以进一步由连接子(linker)连接，所述连接子至少含有一个以上的甘氨酸(Glycine,Gly)，所述连接子包含但不限于：Gly-Gly、Gly-Ser，或如SEQIDNOs:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21所示的序列。在一实施例中，所述连接子具有如SEQIDNO:11所示的氨基酸序列。然而，各个所述抗原决定位氨基酸序列之间，不必然由连接子所连接。本专利技术所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(re-PmT)，可以由下式表示：(抗原决定位1)-(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种败血性巴氏杆菌Pasteurella multocida毒素重组蛋白，其特征在于，包含：一具有如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的败血性巴氏杆菌毒素蛋白的抗原决定位；一具有如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的败血性巴氏杆菌毒素蛋白的抗原决定位；以及一具有如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的败血性巴氏杆菌毒素蛋白的抗原决定位。

【技术特征摘要】
1.一种败血性巴氏杆菌Pasteurellamultocida毒素重组蛋白，其特征在于，包含：一具有如SEQIDNO:2所示氨基酸序列的败血性巴氏杆菌毒素蛋白的抗原决定位；一具有如SEQIDNO:3所示氨基酸序列的败血性巴氏杆菌毒素蛋白的抗原决定位；以及一具有如SEQIDNO:4所示氨基酸序列的败血性巴氏杆菌毒素蛋白的抗原决定位。2.如权利要求1所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白，其特征在于，所述各抗原决定位之间由连接子连接。3.如权利要求2所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白，其特征在于，所述连接子为各自独立选自于由Gly-Gly、Gly-Ser及SEQIDNOs:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21所组成的群组。4.如权利要求1所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白，其特征在于，所述败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白具有如SEQIDNOs:5、22、23、24、25以及26所示序列之一。5.一种含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒，其特征在于，包含：一如权利要求1所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白；以及一乙型肝炎病毒核心蛋白；其中如权利要求1所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白插入所述乙型肝炎病毒核心蛋白的主要免疫显性区域。6.如权利要求5所述的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒，其特征在于，所述乙型肝炎病毒核心蛋白具有如SEQIDNO:6所示的氨基酸序列，以及所述乙型肝炎病毒核心蛋白的主要免疫显性区域为选自于由所述乙型肝炎病毒核心蛋白的第73～94个氨基酸、第73～82个氨基酸、第75～81个氨基酸、第78～79个氨基酸、第78～81个氨基酸、第78～82个氨基酸、第78～86个氨基酸、第78～89个氨基酸、第78～94个氨基酸、第81～82个氨基酸，以及第82～83个氨基酸所组成的群组。7.如权利要求5所述的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒，其特征在于，如权利要求1所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白取代所述乙型肝炎病毒核心蛋白的主要免疫显性区域。8.如权利要求7所述的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒，其特征在于，所述乙型肝炎病毒核心蛋白具有如SEQIDNO:6所示的氨基酸序列，以及所述乙型肝炎病毒核心蛋白的主要免疫显性区域为选自于由所述乙型肝炎病毒核心蛋白的第73～94个氨基酸、第73～82个氨基酸、第75～81个氨基酸、第78～79个氨基酸、第78～81个氨基酸、第78～82个氨基酸、第78～86个氨基酸、第78～89个氨基酸、第78～94个氨基酸、第81～82个氨基酸，以及第82～83个氨基酸所组成的群组。9.如权利要求5所述的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒，其特征在于，如权利要求1所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨滢臻，陈灿坚，
申请(专利权)人：金协国际实业有限公司，
类型：发明
国别省市：中国台湾,71