一种用于干巴菌鉴定的特异性DNA片段、扩增引物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种用于干巴菌鉴定的特异性DNA片段、扩增引物及其制备方法和应用，属于生物技术和酶工程技术领域。所述用于干巴菌鉴定的特异性DNA片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。用于扩增干巴菌鉴定的特异性DNA片段的引物，包括158F引物和437R引物。所述用于干巴菌鉴定的特异性DNA片段、扩增引物或制备方法得到的干巴菌特异性DNA片段在特异性鉴定干巴菌中的应用，具有快速、准确地完成鉴定干巴菌的特点。

A Specific DNA Fragment, Amplified Primers for Identification of Dry Bacillus and Their Preparation and Application

The invention provides a specific DNA fragment, amplification primer, preparation method and application for identification of Dry Bacillus, belonging to the field of biotechnology and enzyme engineering technology. The nucleotide sequence of the specific DNA fragment for identification of Bacillus Drynariae is shown as SEQ ID No.1 in the sequence list. The primers used to amplify specific DNA fragments for identification of Bacillus Drynariae include 158F primers and 437R primers. The application of the specific DNA fragments, amplified primers or prepared methods for the identification of Bacillus Drynariae in the specific identification of Bacillus Drynariae has the characteristics of rapid and accurate identification of Bacillus drynariae.

【技术实现步骤摘要】
一种用于干巴菌鉴定的特异性DNA片段、扩增引物及其制备方法和应用
本专利技术属于菌种分子鉴定
，具体涉及一种用于干巴菌鉴定的特异性DNA片段、扩增引物及其制备方法和应用。
技术介绍
野生食用菌是一种重要的森林资源，在绿色食品开发、生物制药、环境保护等行业中发挥着重要的作用，特别是生长在林区的一些野生食用菌。干巴菌属担子菌门(Basidiomycota)、革菌科(Thelephoraceae)、革菌属(Thelephora)，多生长于滇中和滇南海拔600～2300m的松林中，是能与多种松科植株共生的外生菌根真菌。干巴菌是云南省比较有特色的野生食用菌，口感独特，具有类似牛肉干的香味，营养丰富，具有很高的营养价值和经济价值。已有报道从干巴菌中分离出新的化合物具有较高的抗氧化及抗癌活性，证明其具有潜在的药用价值。目前，人们主要根据野生食用菌子实体的形态学、解剖学等特征来确定野生食用菌的分类及其菌丝体分离物的鉴定。野生食用菌不产生子实体或尚未找到子实体时，就无法进行野生食用菌菌种的鉴定。即使是从野生食用菌的子实体上分离到纯菌种，为避免伴生菌和杂菌的污染所产生的误导，也应遵循柯赫法则进行回接试验，产生相同子实体的鉴定方法是令人信服的。遗憾的是现在很多珍贵的野生食用菌，暂时不能进行人工栽培出菇，在这种情况下就很难断定分离菌株的真伪。干巴菌可以通过成熟子实体的外观区来确定物种，但无法通过菌丝来确定。DNA作为遗传物质能客观和真实地反应物种之间的亲缘关系，对于菌种鉴定是一种有力的依据和补充。以DNA分子为基础的特异性PCR技术是一种对分离纯培养的菌株鉴别的高效、快速而又可靠地方法，已广泛地应用在真菌分离培养物的真伪鉴定方面。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种来源于用于干巴菌鉴定的特异性DNA片段、扩增引物及其制备方法和应用，所述特异性DNA片段为首次提出，具有鉴定准确率高的特点。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种用于干巴菌鉴定的特异性DNA片段，所述用于干巴菌鉴定的特异性DNA片段的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.1所示。本专利技术提供了一种用于扩增用于干巴菌鉴定的特异性DNA片段的引物，包括158F引物和437R引物；所述158F引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.2所示；所述437R引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.3所示。本专利技术提供了一种用于干巴菌鉴定的特异性DNA片段的制备方法，包括以下步骤：(1)提取干巴菌的基因组DNA；(2)以所述步骤(1)中提取的基因组DNA为模板，用权利要求2所述的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；(3)将所述步骤(2)中扩增产物切胶回收，得到用于干巴菌鉴定的特异性DNA片段的DNA片段。优选的，所述PCR扩增的体系为PCR扩增MIX液22.5μl，158F1μl，437R1μl和DNA10μl。优选的，所述PCR扩增的程序：98℃预变性2min；然后98℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35次循环；最后72℃延伸5min。本专利技术提供了所述用于干巴菌鉴定的特异性DNA片段、所述的引物、所述的制备方法制备得到的用于干巴菌鉴定的特异性DNA片段在鉴定干巴菌中的应用。本专利技术提供的用于干巴菌鉴定的特异性DNA片段作为鉴定用分子标签首次提出，对干巴菌的鉴定准确率高达100％。同时本专利技术提供的特异性DNA片段还具有较高的检测特异性。附图说明图1为生长干巴菌的土壤样品的宏基因组分析结果饼状图；图2为生长干巴菌的土壤样品的PCR产物电泳图，其中y为阴性对照；a为生长干巴菌的土壤样品g1；b为生长干巴菌的土壤样品g2；c为生长干巴菌的土壤样品g3；M为2000marker。具体实施方式本专利技术提供了一种用于干巴菌鉴定的特异性DNA片段，所述的特异性DNA片段的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.1所示。所述特异性DNA片段的长度为280bp。所述基因的来源为干巴菌。本专利技术提供了一种用于扩增干巴菌鉴定的特异性DNA片段的引物，包括158F引物和437R引物；所述158F引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.2所示；所述437R引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.3所示。本专利技术对所述引物的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的引物合成公司即可。在本专利技术实施例中，所述引物委托昆明硕擎生物科技有限公司合成。本专利技术对所述引物的设计方法也没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物设计方法即可。本专利技术提供了一种所述的特异性DNA片段的制备方法，包括以下步骤：(1)提取干巴菌的基因组DNA；(2)以所述步骤(1)中提取的基因组DNA为模板，用权利要求2所述的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；(3)将所述步骤(2)中扩增产物切胶回收，得到用于干巴菌鉴定的特异性DNA片段的DNA片段。本专利技术对所述提取的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的手提或试剂盒均可。在本专利技术实施例中，所述提取方法优选采用凯杰公司的DNAIsolationKit(货号为：12888-50)按照说明书的步骤进行DNA提取。提取得到的基因组DNA进行核酸定量检测。基因组DNA浓度高时用缓冲液进行稀释。在PCR扩增时，所述基因组DNA的浓度优选为25ng/μl。本专利技术对所述PCR扩增的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的PCR扩增方法即可。本专利技术对所述PCR扩增用仪器没有特殊限制，采用本领域技术人员常见型号的PCR仪即可。所述PCR扩增的体系优选为PCR扩增MIX液22.5μl，158F1μl，437R1μl和DNA10μl。所述PCR扩增的程序优选如下：98℃预变性2min；然后98℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35次循环；最后72℃延伸5min。本专利技术提供了所述用于干巴菌鉴定的特异性DNA片段、所述的引物或所述的制备方法制备得到的用于干巴菌鉴定的特异性DNA片段。本专利技术对所述鉴定干巴菌的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的PCR扩增方法即可。待测样品中如果出现目标片段，则说明样品中含有干巴菌。下面结合实施例对本专利技术提供的一种用于干巴菌鉴定的特异性DNA片段、扩增引物及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本专利技术保护范围的限定。实施例11、材料生长干巴菌的土壤样品都是在云南省武定县采集到的(见表1)。采集方法：在每个干巴菌生长地，用5点法取以子实体为中心半径5cm，深度14cm的土壤，装入准备好的无菌取样袋中，进行编号，将土样保存在-80℃(生长干巴菌的土壤样品为含有该菌塘的真菌混合样品)。表1样品采集信息编号样品名称位置描述类型g1干巴菌(ThelephoraganbajμnZang)云南省武定县生长干巴菌的土壤样品g2干巴菌(ThelephoraganbajμnZang)云南省武定县生长干巴菌的土壤样品g3干巴菌(ThelephoraganbajμnZang)云南省武定县生长干巴菌的土壤样品2、方法2.1DNA提取DNA提取使用凯杰公司的DNAIsolationKit(货号为：12888-50)进行DNA提取。取表1所列生长干巴菌的土壤样品约300mg(野外采集的土壤样品)，转入PowerBeadTμbespro本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于干巴菌鉴定的特异性DNA片段，其特征在于，所述特异性DNA片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于干巴菌鉴定的特异性DNA片段，其特征在于，所述特异性DNA片段的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.1所示。2.一种用于扩增权利要求1所述的特异性DNA片段的引物，其特征在于，包括158F引物和437R引物；所述158F引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.2所示；所述437R引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.3所示。3.一种权利要求1所述的用于干巴菌鉴定的特异性DNA片段的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取干巴菌的基因组DNA；(2)以所述步骤(1)中提取的基因组DNA为模板，用权利要求2所述的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；(3)将...

【专利技术属性】
技术研发人员：沙涛，杨小雨，张亚平，王丁卉，何志红，
申请(专利权)人：云南大学，
类型：发明
国别省市：云南,53