本发明专利技术公开了一种重组大肠杆菌制备(R)‑对氯环氧苯乙烷的方法，属于生物技术领域。本发明专利技术将番茄来源的环氧化物水解酶在大肠杆菌中表达，构建了基因工程菌E.coli/sleh1，并利用该菌株表达制备重组环氧化物水解酶；提供了一种利用在本发明专利技术中构建的重组菌株发酵所产酶进行生物催化的方法，催化150mM外消旋对氯环氧苯乙烷制备得到对映纯的(R)‑对氯环氧苯乙烷(ee>98％)，并且，其最终产率达到47.5％，接近理论值50％。
A Method for Preparing (R) -p-chloroepiphenylethane from Recombinant Escherichia coli
The invention discloses a method for preparing (R) p-chloroepiphenylethane from recombinant Escherichia coli, which belongs to the field of biotechnology. The present invention expresses the epoxide hydrolase from tomato in E. coli, constructs the genetic engineering bacteria E. coli/sleh1, and uses the expression of the strain to prepare the recombinant epoxide hydrolase. It provides a biocatalytic method by using the enzyme produced by the fermentation of the recombinant strain constructed in the invention to catalyze 150 mM racemic p-chloroepiphenylethane to prepare enantiomerically pure (R). P-chloroepoxy phenylethane (ee > 98%) and its final yield reached 47.5%, close to the theoretical value of 50%.
【技术实现步骤摘要】
一种重组大肠杆菌制备(R)-对氯环氧苯乙烷的方法
本专利技术涉及一种重组大肠杆菌制备(R)-对氯环氧苯乙烷的方法，属于生物
技术介绍
手性环氧化物及其邻二醇是一类高附加值的多功能手性化合物，可用于药物、精细化学品、农药及功能性材料等的合成，具有重要的应用价值。例如，芳香族环氧乙烷及其邻二醇可作为左旋咪唑Levamisole、抗HIV药物(-)-hyperolactoneC、心血管药物硝苯洛尔(R)-Nifenalol、抗抗癌药物依利罗地Eliprodil等的合成前体。目前，对于手性环氧化物及其邻二醇的合成主要有化学合成和生物催化两种方法。然而，化学合成法面临依赖重金属催化剂带来毒性、反应条件苛刻、立体选择性不强和低产率等一系列问题。近年来，环氧化物水解酶(Epoxidehydrolase,EH,EC3.3.2.x)介导的动力学拆分和对映体归一性水解法因其来源广泛、底物谱广、反应条件温和立体选择性高等优点而逐渐走进人们的视野。EHs能催化外消旋环氧化物的选择性开环，通过加成一个水分子生成相应的手性邻二醇或选择性保留手性环氧化物(即对映归一性水解或动力学拆分两种形式)。随着生物技术发展，新EHs不断被发现并且在合成手性中间体中的潜能被不断开发。1993年，Faber等从细菌中筛选到具有EHs活性菌株，如Rhodococcussp.对2-甲基-1,2-环氧庚烷具有高对映选择性。胡蝶等从宇佐美曲霉中成功发掘出一种新型的环氧化物水解酶AuEH2，发现其在动力学拆分外消旋环氧苯乙烷(rac-SO)中具有很大的应用潜力。植物EHs则更加容易获得且原料也较为廉价。李闯等从菜豆基因组中克隆了新型还氧化物水解酶PvEH2，PvEH2对(rac)-SO有极好的对映选择性(E>200)。鉴于此，通过对生物资源的进一步“挖掘”具有较高活性和较高立体选择性的新型EH，进而应用于制备手性环氧化物和邻二醇。将推动EHs产业化生产和应用进程，能产生较大的经济效益。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种重组大肠杆菌，是以大肠杆菌为宿主，表达番茄(Solanumlycopersicum)来源的环氧化物水解酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述环氧化物水解酶的GenBank登录号为AXM43803.1。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以E.coliBL21、E.coliJM109、E.coliDH5α、或E.coliTOP10为宿主。本专利技术的第二个目的是提供构建所述重组大肠杆菌的方法，所述方法是以pET系列的质粒为表达载体，表达编码所述环氧化物水解酶的基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是将番茄来源还氧化物水解酶SlEH1基因克隆到pET-28a(+)的BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位点之间，构建得到重组质粒pET28a(+)-sleh1，再将重组质粒转化到宿主细胞中，得到重组菌。本专利技术的第三个目的是提供一种(R)-对氯环氧苯乙烷(pCSO)的生物转化方法，所述方法是以所述重组大肠杆菌细胞为催化剂，以外消旋对氯环氧苯乙烷(rac-pCSO)进行动力学拆分反应。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌按照0.125～1mg湿菌体细胞/mM底物的比例加入至反应体系中。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是将发酵得到的重组大肠杆菌E.coli/sleh1按照80～150mg/mL湿菌体的比例溶解于浓度为100mmol/L，pH为5.0～10.0的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液中，在20～50℃下加入10～150mMrac-pCSO进行动力学拆分反应，得到手性纯(ees>98％)的(R)-pCSO。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌经过IPTG诱导。在本专利技术的一种实施方式中，所述诱导是加入0.05～1mM的IPTG，在16～30℃下诱导4～16h。在本专利技术的一种实施方式中，所述诱导是将重组大肠杆菌接种到LB培养基中，于37℃下220rpm震荡培养12h，再将培养液按1％接种量接入LB培养基中，于37℃下220rpm震荡培养2.5h，后添加浓度为0.05～1mM的IPTG，在16～30℃下220rpm震荡培养4～16h。在本专利技术的一种实施方式中，所述诱导温度为25℃，诱导时间为8h，IPTG浓度为0.05mM。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法的菌悬液浓度为150mg/mL，反应体系缓冲液pH为7.5，反应温度为25℃。本专利技术还要求保护氨基酸序列如GenBank登录号：AXM43803.1所示的环氧化物水解酶在手性化合物催化，制备药物、精细化学品、农药及功能性材料方面的应用。本专利技术还要求保护所述重组大肠杆菌在制备手性环氧苯乙烷、对氟环氧苯乙烷、对甲基环氧苯乙烷、邻甲苯缩水甘油醚、环氧己烷、环氧辛烷及其邻二醇，以及在药物、精细化学品、农药及功能性材料等合成方面的应用。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术发现了由一种番茄来源环氧化物水解酶基因sleh1表达的重组酶的新应用；与其它来源的环氧化物水解酶相比，其催化rac-pCSO的对映选择性更强，对映体比率(E值)为46.1，大于已报到的PvEH1W102L的25.5和Kau2的35；(2)本专利技术构建的重组大肠杆菌作为催化剂进行生物转化，可以以150mM(已报到最高浓度)rac-pCSO为底物，在单水相中经动力学拆分反应生产手性纯(ees>98％)的(R)-pCSO，产率由已报道的PvEH1W102L的45.6％提高至47.5％(理论产率为50％)。附图说明图1为本专利技术的重组表达载体pET-28a(+)-sleh1的物理图谱。图2为12％SDS-PAGE图谱，其中，M为蛋白分子量Marker；1泳道为没有经过IPTG诱导的E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-sleh1；2泳道为经0.05mmol/LIPTG诱导的E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-sleh1。图3为重组环氧化物水解酶对150mMrac-pCSO的水解反应进程。具体实施方式rac-pCSO购自上海Energy公司；其他试剂均为分析纯。手性正相HPLC色谱柱OD-H(Daicel,Osaka,Japan；250mm×4.6mm)购买自大赛璐药物手性技术(上海)有限公司；高效液相色谱仪(Waterse2695)为美国Waters科技公司产品。酶活测定方法：在实施例2所述的测试条件下，酶活单位(U)定义为每分钟消耗1μmol的pCSO所需的酶量。转化率的计算方法：转化率c(％)＝[(Adiol×ε)/(Adiol×ε+Aepoxide)]×100％，Aepoxide和Adiol分别为HPLC检测出的底物与产物峰的总面积；ε为摩尔消光系数(1.0399)。底物ees，产物eep和产率(％)的计算方法：ees(％)＝[(RS-SS)/(RS+SS)]×100％；eep(％)＝[(Rp-Sp)/(Rp+Sp)]×100％，产率(％)＝(1-c)RS/(RS+SS)，其中RS和SS分别代表(R)-pCSO和(S)-pCSO的浓度，Rp和Sp表示(R)-对氯苯基乙二醇(pCPED)和(S)-pCPED的浓度。E值的计算方法：ln[(1-ees)/(1+ees/ee本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，表达番茄(Solanum lycopersicum)来源的环氧化物水解酶。
【技术特征摘要】
1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，表达番茄(Solanumlycopersicum)来源的环氧化物水解酶。2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述环氧化物水解酶的GenBank登录号为AXM43803.1。3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌以E.coliBL21、E.coliJM109、E.coliDH5α、或E.coliTOP10为宿主。4.构建权利要求1～3任一所述的重组大肠杆菌的方法，其特征在于，以pET系列的质粒为表达载体，表达编码GenBank登录号为AXM43803.1所示环氧化物水解酶的基因。5.含有权利要求1～3任一所述重组大肠杆菌细胞的组合物。6.一种(R)-对氯环氧苯乙烷的生物转化方法，其特征在于，以权利要求1...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡博淳，苏永君，章程，徐雄峰，李闯，胡蝶，李剑芳，邬敏辰，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。