本发明专利技术公开了一种高产5‑甲基四氢叶酸重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。本发明专利技术以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168为表达宿主，通过过量表达5,10‑亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因metF，二氢叶酸还原酶编码基因dfrA，二氢叶酸合成酶编码基因folC、敲除双功能同型半胱氨酸S‑甲基转移酶/5,10‑亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因yitJ，甲酰四氢叶酸脱甲酰酶编码基因purU，得到了积累5‑甲基四氢叶酸枯草芽孢杆菌基因工程菌，5‑甲基四氢叶酸产量达到952.05ug/L，换算细胞干重，产量为342.40ug/g DCW。
Recombinant Bacillus subtilis with high yield of 5-methyltetrahydrofolate and its application
The invention discloses a recombinant Bacillus subtilis with high yield of 5 -methyltetrahydrofolic acid and its application, which belongs to the field of genetic engineering. The present invention takes Bacillus subtilis 168 as the expression host and overexpresses metF, dfrA, folC, yitJ, formyltetrahydrofolate reductase coding gene, yitJ, formyltetrahydrofolate reductase coding gene by overexpressing 5,10 methylenetetrahydrofolate reductase coding gene, folC, knockout bifunctional homocysteine S methyltransferase/5,10 methylenetetrahydrofolate reductase coding gene. PurU, a gene encoding acid deacetylase, was obtained to accumulate 5 -methyltetrahydrofolate Bacillus subtilis. The yield of 5 -methyltetrahydrofolate reached 952.05ug/L, converted to cell dry weight, and the yield was 342.40ug/g DCW.
【技术实现步骤摘要】
一种高产5-甲基四氢叶酸重组枯草芽孢杆菌及其应用
本专利技术涉及一种高产5-甲基四氢叶酸重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。
技术介绍
L-5-甲基四氢叶酸(5-MeTHF)是叶酸在人体内发挥作用的惟一活性形式，是叶酸类药物中唯一能透过血脑屏障的药物。5-MeTHF能预防新生儿神经管缺陷，并具有防治阿尔茨海默病的作用。此外，由于5-MeTHF对正常细胞有较高的选择性保护作用，临床上逐步代替抗肿瘤药甲氨蝶呤的解毒剂5-甲酰四氢叶酸。5-MeTHF也被用于巨幼红细胞性贫血、风湿性关节炎等疾病的治疗。欧盟于2005年底批准5-MeTHF系列产品为安全的食品增补剂，更促进了市场对5-MeTHF的需求。目前，国内5-MeTHF的研究主要集中在化学合成方面，合成方法涉及不对称中心的拆分，此过程中5-MeTHF易失活，收率不理想。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generallyregardedassafe”(GRAS)安全级别，Bacillussubtilis168中存在合成5-甲基四氢叶酸的内源途径，因此运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级5-甲基四氢叶酸的有效途径。然而，枯草芽孢杆菌生产5-甲基四氢叶酸存在诸多问题，例如，5-甲基四氢叶酸的合成与分解代谢同时进行，并且前提物质叶酸的产量也很低，导致野生型菌株5-甲基四氢叶酸产量极低。
技术实现思路
为解决上述科学问题，本专利技术通过增加前体物质供应，并且阻断5-甲基四氢叶酸的分解代谢途径，以提高5-甲基四氢叶酸的产量。本专利技术的第一个目的是构建一种积累5-甲基四氢叶酸的重组枯草芽孢杆菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌敲除了基因组上双功能同型半胱氨酸S-甲基转移酶/5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因yitJ。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌过表达外源5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因metF。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌敲除了甲酰四氢叶酸脱甲酰酶编码基因purU。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌过表达二氢叶酸还原酶编码基因dfrA。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌过表达了二氢叶酸合成酶编码基因folC。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌敲除了基因组上双功能同型半胱氨酸S-甲基转移酶/5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因yitJ，并过表达外源5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因metF。在本专利技术的一种实施方式中，敲除了基因组上双功能同型半胱氨酸S-甲基转移酶/5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因yitJ，敲除了甲酰四氢叶酸脱甲酰酶编码基因purU，并过表达外源5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因metF。在本专利技术的一种实施方式中，敲除了基因组上双功能同型半胱氨酸S-甲基转移酶/5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因yitJ，敲除了甲酰四氢叶酸脱甲酰酶编码基因purU，并过表达外源5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因metF及二氢叶酸还原酶编码基因dfrA。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌敲除枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis168)基因组上双功能同型半胱氨酸S-甲基转移酶/5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶的编码基因yitJ，敲除甲酰四氢叶酸脱甲酰酶的编码基因purU，过表达E.coliK-12MG1655来源的10-亚甲基四氢叶酸还原酶的编码基因metF、二氢叶酸还原酶编码基因dfrA及二氢叶酸合成酶编码基因folC。在本专利技术的一种实施方式中，所述双功能同型半胱氨酸S-甲基转移酶/5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(yitJ)的序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(metF)的序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述甲酰四氢叶酸脱甲酰酶(purU)的序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术的一种实施方式中，所述二氢叶酸还原酶(dfrA)的序列如SEQIDNO.4所示。。在本专利技术的一种实施方式中，其特征在于，所述二氢叶酸合成酶(folC)的序列如SEQIDNO.5所示。本专利技术的第二个目的是提供一种构建上述重组枯草芽孢杆菌的方法，包括如下步骤：1)构建重组片段：通过融合PCR，将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis168)基因组上的双功能同型半胱氨酸S-甲基转移酶/5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因yitJ克隆片段，与同源重组臂以及Spectinomycin-lox抗性基因敲除框融合；通过融合PCR，将大肠杆菌(EscherichiacoliK-12MG1655)基因组上的5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因metF克隆片段，与同源重组臂以及氯霉素抗性(crm)基因融合；通过融合PCR，将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis168)基因组上的甲酰四氢叶酸脱甲酰酶编码基因purU克隆片段，与同源重组臂以及Spectinomycin-lox抗性基因敲除框融合；通过融合PCR，将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis168)基因组上的二氢叶酸还原酶编码基因dfrA克隆片段，与同源重组臂以及crm抗性基因融合；通过融合PCR，将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis168)基因组上的二氢叶酸合成酶编码基因folC克隆片段，与同源重组臂以及crm抗性基因融合；2)构建产5-甲基四氢叶酸(5-MeTHF)重组枯草芽孢杆菌将上述步骤1)中重组片段逐步转化枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168，重组到基因组上，获得生产5-甲基四氢叶酸的重组枯草芽孢杆菌工程菌，命名为A10。本专利技术另一个目的是提供一种上述重组枯草芽孢杆菌在营养保健品方面的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌用于发酵生产含5-甲基四氢叶酸的产品。本专利技术的第三个目的是提供一种生产5-甲基四氢叶酸的方法，所述方法是将所述枯草芽孢杆菌用于发酵生产，具体包括35-38℃、180-220rpm下培养10-20h的重组枯草芽孢杆菌以10％-20％的接种量转入发酵培养基，于35-38℃、180-220rpm条件下发酵8-24h。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基含有(按g/L计)：酵母粉10～15，胰蛋白胨5～8，硫酸铵4～8，四水合磷酸氢二钾12～14，磷酸二氢钾2～3，七水合硫酸镁2～5，葡萄糖50～80。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基含有(按g/L计)：玉米浆12～15，硫酸铵2～5，七水合硫酸镁2～4，谷氨酸0.8～1.2，葡萄糖50～80，对氨基苯甲酸0.2～0.4。本专利技术还要求保护所述重组枯草芽孢杆菌在制备5-甲基四氢叶酸及其相关衍生物方面的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术构建了过表达5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因metF，二氢叶酸还原酶编码基因dfrA，二氢叶酸合成酶编码基因folC克隆片段、敲除双功能同型半胱氨酸S-甲基转移酶/5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因yitJ，甲酰四氢叶酸脱甲酰酶编码基因purU合成5-甲基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高产5‑甲基四氢叶酸的枯草芽孢杆菌，其特征在于，敲除了分解代谢基因yitJ或purU中的至少一种，和/或过表达合成基因metF、dfrA、folC中的至少一种。
【技术特征摘要】
1.一种高产5-甲基四氢叶酸的枯草芽孢杆菌，其特征在于，敲除了分解代谢基因yitJ或purU中的至少一种，和/或过表达合成基因metF、dfrA、folC中的至少一种。2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，(1)敲除了基因组上双功能同型半胱氨酸S-甲基转移酶/5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因yitJ；(2)在(1)的基础上，过表达外源5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因metF；(3)在(2)的基础上，敲除了甲酰四氢叶酸脱甲酰酶编码基因purU；(4)在(3)的基础上，过表达二氢叶酸还原酶编码基因dfrA；(5)在(4)的基础上，过表达二氢叶酸合成酶编码基因folC。3.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述双功能同型半胱氨酸S-甲基转移酶/5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶含有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；所述5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶含有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列；所述甲酰四氢叶酸脱甲酰酶含有SEQIDNO.3所示的氨基酸序列；所述二氢叶酸还原酶含有SEQIDNO.4所示的氨基酸序列；所述二氢叶酸合成酶含有SEQIDNO.5所示的氨基酸序列。4.根据权利要求1～3任一所述枯草芽孢杆菌，其特征在于，以枯...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘延峰，朱进伟，杨晗，彭湘屏，李江华，郑玲辉，陈坚，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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