本发明专利技术提供了一种提高L-5-甲基四氢叶酸累积量的生物合成方法和一种L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒及其构建方法和应用。本发明专利技术提供的L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因folA和亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因metF序列。本发明专利技术提供的提高L-5-甲基四氢叶酸累积量的生物合成方法为，将L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒转化累积L-5-甲基四氢叶酸原始细菌株，获得重组菌并发酵该重组菌。最终发酵产物中L-5-甲基四氢叶酸累积量显著高于原始细菌株，提高了原料利用率，降低了生产成本和能耗，为生物法合成L-5-甲基四氢叶酸的产业化奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于代谢工程
，具体地说，是关于一种提高L-5-甲基四氢叶酸累积量的生物合成方法。
技术介绍
L-5-甲基四氢叶酸又名(6S)-5-甲基四氢叶酸，化学名称为(6S) _N_[4_[ [ (2_氨基-I，4，5，6，7，8-六氢-4-氧-5-甲基_6_喋啶基)甲基]氨基]苯甲酰]-L-谷氨酸。L-5-甲基四氢叶酸是叶酸最具生物活性和功能的形式，在人生命活动中起着不可或缺的作用。普通叶酸只有转换为L-5-甲基四氢叶酸才能参与甲基化过程及DNA合成。L-5-甲基四氢叶酸是体内重要的甲基供体，可参与体内多种生化反应。例如，·L-5-甲基四氢叶酸是叶酸循环中的主要形式，也是同型半胱氨酸甲基化合成蛋氨酸反应的甲基供体，如果缺乏则导致体内同型半胱氨酸含量的升高，造成高同型半胱氨酸血症。高同型半胱氨酸血症是动脉粥样硬化、血栓栓塞、血管损伤的独立致病因素，并与高血脂、脑血管疾病、肾脏疾病、糖尿病、冠状动脉疾病、周围血管病、类风湿关节炎、自然流产及阿尔茨海默症高度相关。L-5-甲基四氢叶酸是人体血浆和细胞内游离叶酸存在的唯一形式，也是唯一可以穿透血脑屏障的叶酸类药物，并对阿兹海默症有很好的防治作用。此外它还可以与抗癌药物甲酰蝶呤等配伍使用，降低药物的毒副作用。L-5-甲基四氢叶酸也被用于巨幼红细胞性贫血、风湿性关节炎等疾病的治疗。叶酸也在肿瘤的发生中起着重要作用。一方面，叶酸受体正成为值得期待的肿瘤治疗靶点，常用的载体为叶酸和叶酸类似物，叶酸类似物主要有L-5-甲基四氢叶酸、亚甲基四氢叶酸等。叶酸与叶酸类似物在其Y羧基与效应分子结合形成叶酸偶联物的过程中，大分子物质的生物活性不会受到破坏。另一方面，叶酸在人体中的主要功能是作为一碳单位载体参与核酸代谢，叶酸缺乏导致肿瘤发生可能有两个机制影响核酸甲基化和破坏DNA完整性。美国、日本和欧洲已经批准将L-5-甲基四氢叶酸上市，作为一种食品添加剂添加到各种食品中，使得其市场需求量剧增。目前，L-5-甲基四氢叶酸的生产主要依靠化学方法合成，但由于其自身稳定性很差，合成工艺复杂，所以并未得到普遍工业化。在合成L-5-甲基四氢叶酸过程中会不可避免的产生难以拆分的光学异构体D-5-甲基四氢叶酸，该异构体不能被人体吸收利用，无治疗保健作用。虽然目前的拆分方法已有不少报道，包括微生物拆分法、化学拆分法、高效液相色谱拆分法等，但拆分效率都不理想，收率也不高。由于化学合成对合成工艺的要求极高，使得生产成本也较高,因此,需要寻找一种新方法降低生产成本，并且得到光学纯度较高的L-5-甲基四氢叶酸。微生物一般都能在常温常压下，利用简单的营养物质生长繁殖，而且代谢旺盛。目前L-5-甲基四氢叶酸的生物合成研究较少。生物体的代谢由酶促反应组成，酶促反应具有高度特异性，一种酶只能特异地产生唯一产物，而不会产生异构体。因此利用生物体的代谢反应，在生物体中合成L-5-甲基四氢叶酸，可以产生唯一的代谢产物，从而解决化学方法难以达到的对光学纯度要求高的难题，是未来发展的趋势，为生物法合成L-5-甲基四氢叶酸的产业化奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒，以用于转化累积L-5-甲基四氢叶酸的原始细菌株。本专利技术还有一个目的在于，提供一种L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒的构建方法。本专利技术还有一个目的在于，提供一种L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒的应用。 本专利技术还有一个目的在于，提供一种提高L-5-甲基四氢叶酸累积量的方法。本专利技术提供的L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒包括二氢叶酸还原酶基因folA序列、亚甲基四氢叶酸还原酶基因metF和一个合适的载体片段；所述folA和metF序列分别如NCBI上Gene ID为944790和948432的序列所示。根据本专利技术的一个优选实施例，在L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒中，folA和metF编码区置于T7启动子和Iac操纵子之下。根据本专利技术的另一个优选实施例，所述L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒还包括一个卡那霉素抗性基因(nptll)，用以筛选重组菌。本专利技术提供的L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒的构建方法包括以下步骤A) PCR扩增获得folA和metF序列；B)将folA和metF序列共同克隆入合适的表达载体。本专利技术提供的L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒可用于转化累积L-5-甲基四氢叶酸的原始细菌株。本专利技术提供的提高L-5-甲基四氢叶酸累积量的生物合成方法包括通过将本专利技术提供的L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒转化累积L-5-甲基四氢叶酸原始细菌株的步骤，获得重组菌。根据本专利技术的一个优选实施例，通过发酵培养该重组菌，提高L-5-甲基四氢叶酸累积量。根据本专利技术的另一个优选实施例，该重组菌为大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)。根据本专利技术的另一个优选实施例，提高L-5-甲基四氢叶酸累积量的生物合成方法还通过，在发酵培养一定时间后，用诱导剂诱导L-5-甲基四氢叶酸代谢途径中的两个关键酶基因-folA和metF的表达。使用本专利技术提供的L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒可以转化累积L-5-甲基四氢叶酸的原始细菌株，获得的重组菌发酵培养，发酵产物中L-5-甲基四氢叶酸累积量显著高于累积L-5-甲基四氢叶酸的原始细菌株E. coli BL21(DE3)。说明采用本专利技术提供的提高L-5-甲基四氢叶酸累积量的方法，提高了原料利用率，降低了生产成本和能耗，可为进一步研究生物法合成L-5-甲基四氢叶酸建立一个基础模型，为生物法合成L-5-甲基四氢叶酸的产业化奠定基础。附图说明图I是PCR扩增获得的folA的检测结果，其中泳道I为folA。图2是PCR扩增获得的metF的检测结果，其中泳道I为metF。图3是质粒pETfοIAmetF的三酶切凝胶电泳检测结果，其中，5350bp左右的条带为质粒pET-28a(+)的DNA片段，900bp左右的条带为基因metF的DNA片段，500bp左右的条带为基因folA的DNA片段。图4是质粒pETfolAmetF的结构示意图。图5是含pETfolAmetF、pETfolA和pETmetF质粒的菌株的可溶性蛋白SDS-PAGE·检测结果，其中泳道I为含pETfolAmetF质粒的菌株，泳道2为含pETmetF质粒的菌株，泳道3为含pETfolA质粒的菌株，泳道4为含pET-28a(+)质粒的空白对照菌株。具体实施例方式以下结合具体实施例，对本专利技术作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限定本专利技术的范围。以下实施例中为注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南精编版》(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2006)中所述的条件或厂商提供的方案进行。在本专利技术的下述实施例中，使用的胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、基因组提取试剂盒均购自生工生物公司。在本专利技术的下述实施例中，使用的pMD-18TSimple Vector,Hind III,Sac I,BamHI,Taq DNA聚合酶，T4 DNA连接酶，DNA Marker,蛋白质Ma本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种L？5？甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒，其特征在于，共表达重组质粒包括二氢叶酸还原酶基因folA序列、亚甲基四氢叶酸还原酶基因metF序列和一合适的载体片段，所述folA和metF序列分别如NCBI上Gene？ID为944790和948432的序列所示。
【技术特征摘要】
1.一种L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒，其特征在于，共表达重组质粒包括二氢叶酸还原酶基因folA序列、亚甲基四氢叶酸还原酶基因metF序列和一合适的载体片段，所述folA和metF序列分别如NCBI上Gene ID为944790和948432的序列所示。2.如权利要求I所述的共表达重组质粒，其特征在于，所述folA和metF序列置于T7启动子和Iac操纵子之下。3.如权利要求I或2所述的共表达重组质粒，其特征在于，所述共表达重组质粒还包括一段抗性基因片段一卡那霉素抗性基因(nptll)。4.如权利要求1-3中任一项所述的共表达重组质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤 A)PCR扩增获得folA和metF序列； B)将folA和metF序列共同克隆到合适的表达载体。5.如权利要求1-3中...
【专利技术属性】
技术研发人员：卞筱泓，许激扬，邵飞，刘娅梅，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：
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