一种完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒及其方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒及其方法。本发明专利技术利用空间邻近化学发光技术实现完全均相检测脂蛋白相关磷脂酶A2，它基于双夹心技术，两单克隆抗体分别结合在脂蛋白相关磷脂酶A2分子的抗原决定簇上；将校准品或待测样本、辣根过氧化物酶标记的抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体、吖啶酯标记的抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体一起加入到微孔板中，无需包被，孵育后两单克隆抗体与样本中的抗原形成抗体‑抗原‑抗体夹心复合物，不需要洗涤过程，加入触发剂后，连续检测一段时间内的发光强度值，并计算样本中脂蛋白相关磷脂酶A2的含量。该试剂盒具有质量稳定、检测快速便捷、灵敏度高、特异性强的特点。

A Kit of Testing Agent for Complete Homogeneous Determination of Lipoprotein-Associated Phospholipase A2 and Its Method

The invention belongs to the field of biotechnology, and discloses a test kit and a method for completely homogeneous determination of lipoprotein-related phospholipase A2. The invention realizes complete homogeneous detection of lipoprotein-related phospholipase A2 by using space proximity chemiluminescence technology. Based on double sandwich technology, two monoclonal antibodies are bound to the antigenic determinants of lipoprotein-related phospholipase A2 molecule respectively; calibration products or samples to be tested, horseradish peroxidase-labeled anti-human lipoprotein-related phospholipase A2 antibodies, acridine ester-labeled anti-human lipoprotein A2 antibodies are added. After incubation, the two monoclonal antibodies and the antigens in the sample form antibody-antigen-antibody sandwich complex. No washing process is needed. After adding the trigger, the luminescence intensity value is continuously measured for a period of time, and the content of lipoprotein-related phospholipase A2 in the sample is calculated. The kit has the characteristics of stable quality, fast and convenient detection, high sensitivity and strong specificity.

【技术实现步骤摘要】
一种完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒及其方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒及其方法。
技术介绍
脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)是磷脂酶A2家族成员，分子量45.4kDa。人血浆Lp-PLA2主要由成熟的巨噬细胞和其他炎症细胞产生。人体内循环中的Lp-PLA2以与脂蛋白颗粒结合的形式存在，其中2/3与低密度脂蛋白结合，1/3与高密度脂蛋白、极低密度脂蛋白(VLDL)结合。故Lp-PLA2既有促动脉粥样硬化的作用，也有抗动脉粥样硬化的作用，但Lp-PLA2流行病学研究发现，Lp-PLA2活性与HDL呈负相关。目前Lp-PLA2促动脉粥样硬化作用的研究较多。结合在LDL上的Lp-PLA2随LDL被运送到血管壁上易受损伤的区域，水解氧化型低密度脂蛋白，水解后产生致炎症反应及致动脉粥样硬化因子溶血卵磷脂和氧化型游离脂肪酸，后两者是促炎介质，不仅能吸引炎性细胞及诱导趋化因子加重斑块炎症反应，而且还能增加斑块的易损性，而斑块破裂导致炎性细胞释放更多Lp-PLA2。目前检测Lp-PLA2的方法比较多，常用方法有免疫荧光法、连续监测法、放射性免疫法、酶联免疫分析法、磁微粒化学发光法、化学发光免疫分析法等。随着生物科技的发展，其检测方法逐渐向酶联免疫吸附试验、化学发光免疫分析法发展。免疫荧光法的主要缺点是非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也比较复杂；连续监测法是指每隔一定时间(2～60s)，连续多次测定酶促反应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法，该方法技术程序也比较复杂，因酶种类和反应条件而异，必须用实验方法进行确定；放射性免疫法具有放射性污染和对人体的损伤，而且还需要较高的实验室条件等；酶联免疫分析法的缺点在于无法准确进行定量，且批间差异较大，线性范围有限，无法持续监控Lp-PLA2水平；化学发光免疫分析法是一种较为先进的免疫学方法，具有高灵敏、高特异、快速、高通量等特点。现阶段化学发光免疫法也逐渐成为检测Lp-PLA2水平的主流方法，并且由于自动化检测系统的普及，极大地提升了实验的精密度。根据目前Lp-PLA2的临床应用情况，市场应用前景较好的可靠方法为化学发光免疫分析法。化学发光免疫分析法主要有微孔板式化学发光和微孔板式磁颗粒化学发光。目前实验室检测脂蛋白相关磷脂酶A2出现了一种化学发光检测方法，如中国专利申请CN201510068055公开了一种脂蛋白相关磷脂酶A2微孔板式磁颗粒化学发光免疫分析测定试剂盒，在微孔板上使用磁颗粒，将亲和素-生物素桥联包被抗体，加入抗原和酶标抗体形成生物素化的抗体-抗原-酶标抗体复合物，将微孔板置于带有磁分离器的微孔板洗板机上洗涤，加入化学发光底物反应，而后检测其发光强度(RLU)，脂蛋白相关磷脂酶A2浓度与发光强度(RLU)成正相关。该方法具有检测范围宽，操作简单等特点，但需要洗涤过程，会产生大量的废弃物，且反应时间较长，不利于临床上大批量快速检测的需求。因此，针对上述技术问题，有必要提供一种质量稳定，检测快速便捷，灵敏度高，特异性强的用于测定血液中脂蛋白相关磷脂酶A2的试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒及其方法，该试剂盒利用空间邻近化学发光技术实现完全均相检测脂蛋白相关磷脂酶A2，具有质量稳定，检测快速便捷，灵敏度高，特异性强的特点。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：一种完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2和触发剂，所述试剂R1包括吖啶酯标记的抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体，所述试剂R2包括辣根过氧化物酶(HRP)标记抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体和抗氧化剂。本专利技术试剂盒的检测原理为：分别加入待测样本或校准品、吖啶酯标记抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体、辣根过氧化物酶标记抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体形成抗体-抗原-抗体复合物，无需洗涤过程，加入抗氧化剂和触发剂后立即连续检测一段时间(通常是1～3s)内的发光强度，并计算其峰面积，与标准曲线对比，即可计算出样本中脂蛋白相关磷脂酶A2的含量，脂蛋白相关磷脂酶A2的含量与其峰面积成正相关。本专利技术能够取得上述效果关键点在于，辣根过氧化物酶可氧化触发剂产生自由基，自由基随即氧化抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体上的吖啶酯，由于自由基的半衰期非常短，只能在分子内扩散，故只有形成抗体-抗原-抗体复合物才能反应发光。抗氧化剂能够防止自由基与游离的吖啶酯反应，有效降低了本底，从而提高了检测试剂盒的准确度和灵敏度。其与以往的化学发光法相比，最主要的区别在于，本专利技术检测方法为空间邻近化学发光法，属于完全均相检测，是最接近体内自然状态的反应，具有简单快速、检查范围宽的特点。本试剂盒无需进行包被处理，没有改变抗体的空间结构，使抗体结合表位充分暴露，保留最强的特异性，使试剂盒具有更高的灵敏度和准确度；无需洗涤过程，大大优化了工艺流程，对试剂盒的各性能均有较大的保障。因此，本试剂盒具有检测范围宽、检测快速便捷、灵敏度高、特异性及重复性好等特点，且减少了大量废弃物的排放，更适合临床上使用。进一步地，所述抗氧化剂包括抗坏血酸，抗坏血酸能够防止自由基与游离的吖啶酯反应，确保自由基只能在抗体-抗原-抗体复合物的分子内传递，从而降低了本底，提高了检测结果的准确性。进一步地，所述触发剂为包括H2O2和对羟基肉桂酸。进一步地，所述试剂R1包括下述浓度的组分：吖啶酯标记抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体0.5-10mg/L，所述试剂R2包括下述浓度的组分：辣根过氧化物酶标记抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体0.1-2mg/L；抗坏血酸0.01-1w/v％所述触发剂包括下述浓度的组分：H2O20.01-10w/v％对羟基肉桂酸0.01-10w/v％，进一步地，所述试剂盒还包括缓冲液、稳定剂和防腐剂。进一步地，所述试剂R1包括下述浓度的组分：所述试剂R2包括下述浓度的组分：触发剂包括下述浓度的组分：H2O20.01-0.5w/v％对羟基肉桂酸0.01-4w/v％进一步地，所述缓冲液的pH为6.5-8.5，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、醋酸缓冲液、HEPES缓冲液中的至少一种，更进一步地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。进一步地，所述稳定剂为牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、甘露醇、乙二胺四乙酸二钠、PEG20000、吐温-20、EC氧化酶、酶稳定剂、甘油中的至少一种，优选地，所述稳定剂为牛血清白蛋白、PEG20000、EC氧化酶、吐温-20和甘露醇。进一步地，所述防腐剂为叠氮钠、ProClin300、KY-100生物防腐剂中的至少一种，更进一步地，所述试剂R1和试剂R2中ProClin300的浓度为0.045-0.5w/v％。本专利技术还提供了上述的完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒的检测方法，在待测样本中加入试剂R1和试剂R2，在37℃孵育5-30min，加入触发剂，立即检测反应物的发光强度值，计算待测样本中脂蛋白相关磷脂酶A2的含量，其中，待测样本、试剂R1、试剂R2、抗氧化剂和触发剂的体积比为1:8:8:15。与现有本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒，其特征在于，包括试剂R1、试剂R2和触发剂，所述试剂R1包括吖啶酯标记的抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体，所述试剂R2包括辣根过氧化物酶标记抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体和抗氧化剂。

【技术特征摘要】
1.一种完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒，其特征在于，包括试剂R1、试剂R2和触发剂，所述试剂R1包括吖啶酯标记的抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体，所述试剂R2包括辣根过氧化物酶标记抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体和抗氧化剂。2.根据权利要求1所述的完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒，其特征在于，所述抗氧化剂包括抗坏血酸、尿酸、茶多酚、谷胱甘肽、硫代硫酸钠中的至少一种，优选地，所述抗氧化剂为抗坏血酸和硫代硫酸钠。3.根据权利要求1所述的完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒，其特征在于，所述触发剂为对羟基肉桂酸、过氧化氢、过氧化脲中的至少一种，优选地，所述触发剂为对羟基肉桂酸和过氧化氢。4.根据权利要求1～3任一项所述的完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1包括下述浓度的组分：吖啶酯标记抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体0.5-10mg/L所述试剂R2包括下述浓度的组分：辣根过氧化物酶标记抗人脂蛋白相关磷脂酶A2抗体0.1-2mg/L抗坏血酸0.01-1w/v％所述触发剂包括下述浓度的组分：H2O20.01-10w/v％对羟基肉桂酸0.01-10w/v％。5.根据权利要求4所述的完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括缓冲液、稳定剂和防腐剂。6.根据权利要求5所述的完全均相测定脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂盒，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘忠贵，李民友，张玲，罗宁，高国全，杨霞，段朝晖，
申请(专利权)人：广州市进德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44