一种鼠伤寒沙门菌MLVA分型的检测引物组、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种鼠伤寒沙门菌MLVA分型的检测引物组、试剂盒及应用。本发明专利技术针对鼠伤寒沙门菌4个具有较好分辨能力的VNTR位点设计特异性引物，建立多重PCR扩增检测方法，对各位点PCR扩增产物片段进行测序，采用本地Blast技术对测序结果进行分析，获得4个位点重复序列数目组合，对鼠伤寒沙门菌进行MLVA分型。本发明专利技术的方法可对鼠伤寒沙门菌进行稳定的分型检测，仅分析4个VNTR位点、一次多重PCR扩增检测、直观方便的本地Blast分析获得VNTR重复序列数目，其分辨率与原MLVA‑5点分型方法相同，但分型效率高于原有MLVA‑5位点法，更简单、方便。

【技术实现步骤摘要】
一种鼠伤寒沙门菌MLVA分型的检测引物组、试剂盒及其应用
：本专利技术属于微生物
，具体涉及一种鼠伤寒沙门菌MLVA分型的检测引物组、试剂盒及其应用。
技术介绍
：沙门菌(Salmonellaspp)是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病病原菌，可引起人和动物的伤寒、副伤寒、胃肠炎和败血症等许多严重疾病，使全球遭受巨大的经济损失。目前，全世界已发现约2610种沙门菌血清型。其中，鼠伤寒沙门菌(Salmonellaentericasubsp.entericaserovarTyphimurium，STM)是存在于畜禽及食品中的优势血清型，也是引起人类感染的主要血清型。采用有效的分型方法对不同来源、不同血清型甚至不同致病力的沙门菌加以区分，对沙门菌危害溯源、风险预警和疫情监测具有重要意义。多位点可变数目串联重复序列分析(Multiple-locusvariable-numbertandem-repeatanalysis，MLVA)分型方法是利用不同微生物基因组中不同位点串联重复序列(Variable-numbertandem-repeat，VNTR)数目的不同，对其进行分型，被广泛用于微生物，尤其是细菌的研究。MLVA分型方法操作简单、快速、分辨率高，得到明确的数字化的结果，重复性好，利于各实验室间交流和共享数据、比较结果。2004年Lindstedt等利用鼠伤寒沙门菌的5个VNTR位点-STTR9、STTR5、STTR6、STTR10和STTR3成功建立了用于鼠伤寒沙门菌的MLVA-5位点分型方法，该方法大大提高了对鼠伤寒沙门菌多态性的分辨能力。该方法用两个复合PCR体系分别扩增5个VNTR位点，然后通过毛细管电泳法检测产物，获得VNTR位点重复序列数目。随着测序技术的发展，MLVA中VNTR位点重复序列数目的确定，逐渐发展为更加方便、精确的对VNTR位点序列信息的分析。在对大量样本的实验验证中发现，原MLVA-5位点分型方法中STTR9、STTR5、STTR6、STTR10位点的分辨率高，重复序列短(6-9bp)，但STTR3位点的重复序列却很长，而且有2种，分别是27bp和33bp，长序列的重复片段影响了序列分析的准确性，从而影响了结果的可靠性，而且研究中发现STTR3位点的多态性并不能提高整个方法的分辨率。同时，该MLVA-5位点方法中各VNTR位点扩增过程不能在同一反应体系中完成。
技术实现思路
：本专利技术的目的是为了克服现有技术中的缺陷，提供一种更有效、更简便、高分辨率的鼠伤寒沙门菌MLVA分型的检测引物组、试剂盒及其应用。本专利技术针对鼠伤寒沙门菌具有较好分辨能力的VNTR位点——MLVA1(即STTR9)、MLVA2(即STTR5)、MLVA3(即STTR6)、MLVA4(即STTR10)，分别设计可用于多重PCR扩增的特异性引物序列，建立多重PCR扩增检测方法；在结果判定中，采用简便、直观的本地Blast序列分析技术确定4个VNTR区的重复序列数目组合，以对鼠伤寒沙门菌进行MLVA分型。克服原有鼠伤寒沙门菌MLVA分型方法的弊端，采用更少的VNTR位点、更有效的一次多重PCR扩增检测，以及利用本地Blast序列分析的更直观、方便的结果判定方法，建立一种鼠伤寒沙门菌MLVA分型方法。本专利技术的第一个目的是提供一种鼠伤寒沙门菌MLVA分型的检测引物组，由下列引物组成：针对MLVA1位点：MLVA1-F：5’-CCGGTACTGTCAGGGAAAGA-3’(如SEQIDNO.5所示)，MLVA1-R：5’-AGCATACCAAACGACCGCTA-3’(如SEQIDNO.6所示)；针对MLVA2位点：MLVA2-F：5’-GCTGGATGTTCTGGCGGAC-3’(如SEQIDNO.7所示)，MLVA2-R：5’-GAATATCGGCAGCATGGG-3’(如SEQIDNO.8所示)；针对MLVA3位点：MLVA3-F：5’-CGTTTATTCGGGCATGCG-3’(如SEQIDNO.9所示)，MLVA3-R：5’-TCTGGTGGGGAGAATGACTG-3’(如SEQIDNO.10所示)；针对MLVA4位点：MLVA4-F：5’-AAGAATGCCCCGGAATATGC-3’，MLVA4-R：5’-AGCATGACAGTCCCGGTTC-3’(如SEQIDNO.12所示)。本专利技术的第二个目的是提供一种鼠伤寒沙门菌MLVA分型试剂盒，包括多重PCR扩增试剂和检测引物组，所述的检测引物组由下列引物组成：针对MLVA1位点：MLVA1-F：5’-CCGGTACTGTCAGGGAAAGA-3’(如SEQIDNO.5所示)，MLVA1-R：5’-AGCATACCAAACGACCGCTA-3’(如SEQIDNO.6所示)；针对MLVA2位点：MLVA2-F：5’-GCTGGATGTTCTGGCGGAC-3’(如SEQIDNO.7所示)，MLVA2-R：5’-GAATATCGGCAGCATGGG-3’(如SEQIDNO.8所示)；针对MLVA3位点：MLVA3-F：5’-CGTTTATTCGGGCATGCG-3’(如SEQIDNO.9所示)，MLVA3-R：5’-TCTGGTGGGGAGAATGACTG-3’(如SEQIDNO.10所示)；针对MLVA4位点：MLVA4-F：5’-AAGAATGCCCCGGAATATGC-3’，MLVA4-R：5’-AGCATGACAGTCCCGGTTC-3’(如SEQIDNO.12所示)。本专利技术的第三个目的是提供一种非疾病的诊断和治疗目的的鼠伤寒沙门菌MLVA分型方法，包括以下步骤：提取待测鼠伤寒沙门菌的基因组DNA作为模板，以所述的MLVA1-F/MLVA1-R、MLVA2-F/MLVA2-R、MLVA3-F/MLVA3-R和MLVA4-F/MLVA4-R作为扩增引物进行多重PCR扩增，对多重PCR扩增产物进行测序，根据测序结果对待测鼠伤寒沙门菌进行MLVA分型。所述的多重PCR扩增的反应体系优选为25μL，包括10×PCRbuffer2.5μL，3.0mmol/LMgCl2，250μmol/LdNTP，引物MLVA1-F/MLVA1-R、MLVA2-F/MLVA2-R、MLVA3-F/MLVA3-R和MLVA4-F/MLVA4-R各120nmol/L，1.5UTaq酶，模板2μL，余量为ddH2O。所述的多重PCR扩增的反应条件优选为95℃预变性5min；95℃变性45s、58℃退火45s、72℃延伸45s，共进行30个循环；72℃延伸10min。所述的根据测序结果对待测鼠伤寒沙门菌进行MLVA分型具体为根据测序结果采用本地Blast分析法对待测鼠伤寒沙门菌MLVA1、MLVA2、MLVA3、MLVA4位点重复数结果判定，根据4个位点的重复数对待测鼠伤寒沙门菌进行MLVA分型。MLVA1、MLVA2、MLVA3、MLVA4位点的重复序列短，分别为9bp、6bp、6bp、6bp，利用本地Blast分析VNTR位点的重复序列数目进行更方便、直观的结果判定。根据测序结果对待测鼠伤寒沙门菌进行MLVA分型可以采用公式法或本地Blast分析法。采用公式法：根据测序结果本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鼠伤寒沙门菌MLVA分型的检测引物组，其特征在于，由下列引物组成：针对MLVA1位点：MLVA1‑F：5’‑CCGGTACTGTCAGGGAAAGA‑3’，MLVA1‑R：5’‑AGCATACCAAACGACCGCTA‑3’；针对MLVA2位点：MLVA2‑F：5’‑GCTGGATGTTCTGGCGGAC‑3’，MLVA2‑R：5’‑GAATATCGGCAGCATGGG‑3’；针对MLVA3位点：MLVA3‑F：5’‑CGTTTATTCGGGCATGCG‑3’，MLVA3‑R：5’‑TCTGGTGGGGAGAATGACTG‑3’；针对MLVA4位点：MLVA4‑F：5’‑AAGAATGCCCCGGAATATGC‑3’，MLVA4‑R：5’‑AGCATGACAGTCCCGGTTC‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种鼠伤寒沙门菌MLVA分型的检测引物组，其特征在于，由下列引物组成：针对MLVA1位点：MLVA1-F：5’-CCGGTACTGTCAGGGAAAGA-3’，MLVA1-R：5’-AGCATACCAAACGACCGCTA-3’；针对MLVA2位点：MLVA2-F：5’-GCTGGATGTTCTGGCGGAC-3’，MLVA2-R：5’-GAATATCGGCAGCATGGG-3’；针对MLVA3位点：MLVA3-F：5’-CGTTTATTCGGGCATGCG-3’，MLVA3-R：5’-TCTGGTGGGGAGAATGACTG-3’；针对MLVA4位点：MLVA4-F：5’-AAGAATGCCCCGGAATATGC-3’，MLVA4-R：5’-AGCATGACAGTCCCGGTTC-3’。2.一种鼠伤寒沙门菌MLVA分型试剂盒，其特征在于，包括多重PCR扩增试剂和检测引物组，所述的检测引物组由下列引物组成：针对MLVA1位点：MLVA1-F：5’-CCGGTACTGTCAGGGAAAGA-3’，MLVA1-R：5’-AGCATACCAAACGACCGCTA-3’；针对MLVA2位点：MLVA2-F：5’-GCTGGATGTTCTGGCGGAC-3’，MLVA2-R：5’-GAATATCGGCAGCATGGG-3’；针对MLVA3位点：MLVA3-F：5’-CGTTTATTCGGGCATGCG-3’，MLVA3-R：5’-TCTGGTGGGGAGAATGACTG-3’；针对MLVA4位点：MLVA4-F：5’-AAGAATGCCCCGGAATATGC-3’，MLVA4-R：5’-AGC...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨小鹃，吴清平，张菊梅，曾海燕，余树波，王涓，薛亮，吴浩明，张淑红，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所广东省微生物分析检测中心，
类型：发明
国别省市：广东,44