一种用于检测假单胞菌属细菌的特征性核苷酸序列及其特异性引物、试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测假单胞菌属细菌的特征性核苷酸序列及其特异性引物、试剂盒和检测方法。本发明专利技术从NCBI数据库中下载假单胞菌(61株)和非假单胞菌(38株)的全基因组序列，通过比较基因组的方法寻找假单胞菌属特异性基因，通过DNAMAN 8软件对特异性基因进行序列比对，寻找假单胞菌属特异性基因的保守片段，利用Oligo7软件设计仅能扩增假单胞菌属特异性基因的引物。本发明专利技术的特异性引物特异性强，灵敏度高，检测结果准确。本发明专利技术的检测方法稳定性好，可用于生鲜肉中假单胞菌属细菌的定量检测。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测假单胞菌属细菌的特征性核苷酸序列及其特异性引物、试剂盒和检测方法
：本专利技术属于分子生物学检测领域，具体涉及用于检测假单胞菌属细菌的特征性核苷酸序列及其特异性引物、试剂盒和检测方法。
技术介绍
：假单胞菌是一种革兰氏阴性、专性需氧、无芽孢、非发酵杆菌。目前，假单胞菌属共有上百个种，包括铜绿假单胞菌群(铜绿假单胞菌、产碱假单胞菌、假产碱假单胞菌等)、绿针假单胞菌群(绿针假单胞菌、草莓假单胞菌等)、荧光假单胞菌群(荧光假单胞菌、类黄假单胞菌等)、穿孔假单胞菌群(脱氮假单胞菌和穿孔假单胞菌)、恶臭假单胞菌群(恶臭假单胞菌、香鱼假单胞菌等)、施氏假单胞菌群(浅黄假单胞菌、施氏假单胞菌等)、丁香假单胞菌群(褐鞘假单胞菌、绿黄假单胞菌等)等，其中铜绿假单胞菌为代表菌种。食品腐败主要是由食品本身存在的酶以及微生物产生的各种酶引发的。据报道，生鲜产品的腐败率超过35％，其中肉类和水产品占据了10％-15％，为我国的食品行业带来很大的经济损失(王永锋2012)。生鲜产品的腐败变质主要是由于微生物的代谢活动引起的(Kodogiannis,Pachidisetal.2014,Gopal,Hilletal.2015)，当微生物的数量达到一定值时则会引起食品的腐败(Jones2004)，如感官颜色的变化、腐臭味、粘液等，研究表明假单胞菌属是新鲜肉类产品中主要的腐败菌，如荧光假单胞菌、草莓假单胞菌、恶臭假单胞菌等(AndreaniandFasolato2017)。对肉类产品中的假单胞菌属进行快速检测，能够在合理的时间内采取措施以提高货架期，最大限度的减少生鲜肉的损失。目前，对生鲜肉中腐败微生物的检测方法主要包括传统的培养方法、16SrDNA一代基因测序、高通量测序、荧光定量PCR等方法(Olsson,Ahrneetal.2003,Handelsman2004,Russo,Ercolinietal.2006,Broekaert,Heyndrickxetal.2011,Noseda,Islametal.2012)。传统的培养方法可准确的鉴定并计数微生物的菌落数，但该方法只能鉴定可培养的微生物，后期需进行各种生化反应，耗时耗力。16SrDNA一代基因测序可鉴定出腐败微生物的种类，但是无法对微生物进行准确的定量。高通量测序技术可用于分析样本中微生物的多样性以及动态变化，通过该方法可确定样本中的优势微生物，但是仍无法对微生物进行计数。荧光定量PCR检测法既可以对微生物的种类进行定性检测，也可对微生物的数量进行定量检测。但是，目前对微生物的荧光定量PCR检测方法局限于种水平上的微生物，缺乏对属水平上的微生物的检测。造成食品腐败的微生物并非单一微生物作用的结果，而是多种微生物共同作用的结果，因此，对微生物进行属水平上的检测具有重要意义。
技术实现思路
：本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于检测假单胞菌属细菌的特征性核苷酸序列及其特异性引物、试剂盒和检测方法。本专利技术从NCBI数据库中下载假单胞菌(61株)和非假单胞菌(38株)的全基因组序列，通过比较基因组的方法使用Perl编程语言寻找假单胞菌属特异性基因，对特异性基因于NCBI数据库中进行比对验证基因的特异性，然后通过DNAMAN8软件对假单胞菌属特异性基因进行序列比对，寻找假单胞菌属特异性基因的保守片段，利用Oligo7软件设计仅能扩增假单胞菌属特异性基因的引物，建立一种假单胞菌属细菌荧光定量PCR检测方法，能够鉴定假单胞菌属细菌。因此，本专利技术的第一个目的是提供一种用于检测假单胞菌属细菌的特征性核苷酸序列，所述的特征性核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术的第二个目的是提供一种用于检测假单胞菌属细菌的特异性引物，所述的特异性引物如下所示：上游引物sucDF：5’-CGTCCTGATCAATAAAGACACC-3’(如SEQIDNO.1所示)；下游引物sucDR：5’-GATGCAGACGATCAGCTTG-3’(如SEQIDNO.2所示)。本专利技术的第三个目的是提供一种假单胞菌属细菌的荧光定量PCR检测试剂盒，包括所述的特异性引物。所述的荧光定量PCR检测试剂盒，还包括2×TBGreenTMPremix和无核酸酶纯水。本专利技术的第四个目的是提供一种非疾病的诊断和治疗目的的假单胞菌属细菌的检测方法，包括以下步骤：提取待测样品的基因组DNA作为模板，利用所述的特异性引物sucDF和sucDR进行PCR扩增，扩增产物进行电泳检测，若扩增出条带，则待测样品中含有假单胞菌属细菌，若没有扩增出条带，则待测样品中不含有假单胞菌属细菌。所述的PCR扩增的反应体系优选为20μL：包括2×TaqMasterMix10μL、模板DNA2μL、10μM上游引物sucDF0.6μL、10μM下游引物sucDR0.6μL和无核酸酶纯水6.8μL。所述的PCR扩增的反应条件优选为：94℃预变性3min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。本专利技术的第五个目的是提供一种假单胞菌属细菌荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：(1)将铜绿假单胞菌ATCC27853的纯培养物进行梯度稀释，提取不同浓度铜绿假单胞菌ATCC27853的纯培养物的基因组DNA作为模板，采用权利要求2所述的特异性引物sucDF和sucDR进行荧光定量PCR扩增反应；(2)以模板对应的铜绿假单胞菌ATCC27853的纯培养物浓度的对数为横坐标，以相应的阈值循环数为纵坐标，建立假单胞菌属的标准曲线；(3)提取待测样品的基因组DNA作为模板，采用所述的特异性引物sucDF和sucDR进行荧光定量PCR扩增反应，反应后得到阈值循环数，将其代入假单胞菌属的标准曲线，计算得到待测样品中假单胞菌属细菌的含量。所述的荧光定量PCR扩增反应的反应体系优选为20μL：包括2×TBGreenTMPremix10μL、模板DNA2μL、10μM上游引物sucDF0.6μL、10μM下游引物sucDR0.6μL和无核酸酶纯水6.8μL。所述的荧光定量PCR扩增反应的反应条件优选为：95℃预变性30s；95℃变性5s、60℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：(1)快速、简便、费用低：相比传统培养方法以及16SrDNA一代基因测序，假单胞菌属细菌荧光定量PCR检测方法更加快速，这个鉴定过程不超过3.5h。采用传统的培养方法和生化鉴定，需耗时3-4天，操作繁琐，购买培养基与试剂的成本昂贵。16SrDNA一代基因测序，需要专业公司进行测序、专业人员进行结果分析，期间耗时2-3天，而且无法对假单胞菌属细菌进行定量。(2)灵敏度高：将假单胞菌的纯培养物，使用去离子水按照10倍梯度稀释，得浓度为101，102，103，104，105，106，107，108CFU/mL的菌株纯培养物。然后，对上述各稀释度的假单胞菌纯培养物提取DNA模板，分别取一定量作为荧光定量PCR反应的模板，检测最低检测下限，做标准曲线。通过实验，结果表明假单胞菌属细菌DNA模板最低检测限为102CFU/mL，标准曲线为y＝-3.2034x+40.364，R2＝0.9956。(3)特异性强：利用建立的假本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测假单胞菌属细菌的特征性核苷酸序列，其特征在于，所述的特征性核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测假单胞菌属细菌的特征性核苷酸序列，其特征在于，所述的特征性核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。2.一种用于检测假单胞菌属细菌的特异性引物，其特征在于，所述的特异性引物如下所示：上游引物sucDF：5’-CGTCCTGATCAATAAAGACACC-3’；下游引物sucDR：5’-GATGCAGACGATCAGCTTG-3’。3.一种假单胞菌属细菌的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的特异性引物。4.根据权利要求3所述的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括2×TBGreenTMPremix和无核酸酶纯水。5.一种非疾病的诊断和治疗目的的假单胞菌属细菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测样品的基因组DNA作为模板，利用权利要求2所述的特异性引物sucDF和sucDR进行PCR扩增，扩增产物进行电泳检测，若扩增出条带，则待测样品中含有假单胞菌属细菌，若没有扩增出条带，则待测样品中不含有假单胞菌属细菌。6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述的PCR扩增的反应体系为20μL：包括2×TaqMasterMix10μL、模板DNA2μL、10μM上游引物sucDF0.6μL、10μM下游引物sucDR0.6μL和无核酸酶纯水6.8μL。7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述的PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3min；94...

【专利技术属性】
技术研发人员：张菊梅，李宁，吴清平，古其会，张友雄，蔡淑珍，柏建玲，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所广东省微生物分析检测中心，
类型：发明
国别省市：广东,44