基于化学发光的可同时检测多种农兽药残留的生物芯片及检测方法技术

本发明专利技术提供了一种基于化学发光的可同时检测多种农兽药残留的生物芯片，所述生物芯片包括固定有一组检测目标物抗原的芯片载体，所述检测目标物为农药和/或兽药，所述生物芯片由以下方法制成：以牛血清白蛋白为空白对照，将牛血清白蛋白和检测目标物抗原通过生物芯片制备系统在芯片载体上点样操作后，于20‑37℃水浴中孵育0.5‑4h，洗涤后晾干即得。还提供了利用上述生物芯片同时采用化学发光检测多种农药、兽药的方法。该生物芯片结构简单、制备工艺简单、成本低、多靶标、准确度高、灵敏度高、精密度高、检测时间短、操作简单易行，无需昂贵的检测仪器，适用于现场大规模样品的初筛。

【技术实现步骤摘要】
基于化学发光的可同时检测多种农兽药残留的生物芯片及检测方法
本专利技术属于食品安全监督或食品分析的免疫分析技术，特别涉及一种基于化学发光的可同时检测多种农兽药残留的生物芯片及检测方法。
技术介绍
使用农药、兽药是目前世界各国在农业种植中防止农作物病虫害和畜禽水产养殖中防止病害的有效手段。但是，大量农药、兽药的使用，给整个生态系统和食品安全带来了巨大的安全威胁，成为危害人类健康的“杀手”。农药残留(Pesticideresidues)，是农药使用后一个时期内没有被分解而残留于生物体、收获物、土壤、水体、大气中的微量农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称。按照化学结构，农药可以分为有机磷类、有机氯类、拟除虫菊类、烟碱类等。农药残留问题是随着农药大量生产和广泛使用而产生的。到目前为止，世界上化学农药年产量近200万吨，约有1000多种人工合成化合物被用作杀虫剂、杀菌剂、杀藻剂、除虫剂、落叶剂等类农药。农药尤其是有机农药大量施用，造成严重的农药污染问题，成为对人体健康的严重威胁。食用含有大量高毒、剧毒农药残留引起的食物会导致人、畜急性中毒事故。长期食用农药残留超标的农副产品，虽然不会导致急性中毒，但可能引起人和动物的慢性中毒，导致疾病的发生，甚至影响到下一代。农药进入粮食、蔬菜、水果、鱼、虾、肉、蛋、奶中，造成食物污染，危害人的健康。一般有机氯农药在人体内代谢速度很慢，累积时间长。有机氯在人体内残留主要集中在脂肪中。如DDT在人的血液、大脑、肝和脂肪组织中含量比例为1:4:30:300；狄氏剂为1:5:30:150。食用含有大量高毒、剧毒农药残留引起的食物会导致人、畜急性中毒事故。长期食用农药残留超标的农副产品，虽然不会导致急性中毒，但可能引起人和动物的慢性中毒，导致疾病的发生，甚至影响到下一代。由于农药残留对人和生物危害很大，各国对农药的施用都进行严格的管理，并对食品中农药残留容许量作了规定。兽药残留(residuesofveterinarydrug)是指用药后蓄积或存留于畜禽机体或产品(如鸡蛋、奶品、肉品等)中原型药物或其代谢产物，包括与兽药有关的杂质的残留。兽药在防治动物疾病、提高生产效率、改善畜产品质量等方面起着十分重要的作用。然而，由于养殖人员对科学知识的缺乏以及一味地追求经济利益，致使滥用兽药现象在当前畜牧业中普遍存在。滥用兽药极易造成动物源食品中有害物质的残留，这不仅对人体健康造成直接危害，而且对畜牧业的发展和生态环境也造成极大危害。长期食用兽药残留超标的食品后，当体内蓄积的药物浓度达到一定量时会对人体产生多种急慢性中毒。动物机体长期反复接触某种抗菌药物后，其体内敏感菌株受到选择性的抑制，从而使耐药菌株大量繁殖；此外，抗药性R质粒在菌株间横向转移使很多细菌由单重耐药发展到多重耐药。耐药性细菌的产生使得一些常用药物的疗效下降甚至失去疗效，如青霉素、氯霉素、庆大霉素、磺胺类等药物在畜禽中已大量产生抗药性，临床效果越来越差。研究发现许多药物具有致癌、致畸、致突变作用。食品安全检验检测是食品安全监管的重要手段之一，它为食品安全监管提供了重要的技术支撑。目前，国内外关于农药兽药残留的主要检测方法有两类：理化检测法和免疫分析法。理化检测法是利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应或性质来测定含量的方法，如高效液相色谱法、气相色谱法、比色法、荧光分光光度法，其中最常用的是高效液相色谱法(HPLC)和色谱质谱联用法(TLC-MS，GC-MS，LC-MS等)。理化检测法对设备要求高，技术难度大，对技术人员要求高，操作繁琐，需要大量复杂的样品前处理操作，不适合现场监控和大量样本的筛查。免疫分析法是基于抗原抗体识别或者受体配体识别来测定抗生素含量的分析方法，如酶联免疫吸附法(ELISA)和受体吸附分析法。这类方法具有灵敏度高、特异性强、操作简单的优点，然而现有的免疫分析法如ELISA无法同时测定多个目标物。如需测定样品中的多种抗生素，则需要进行多次试验，需要耗费较多的时间与材料。此外，针对抗生素检测，使用较多的还有微生物法。微生物学检测方法是利用抗生素对微生物的生理机能、代谢的抑制作用来定性或定量确定样品中抗生素残留的方法，如微生物生长抑制法、微生物受体法、酶比色法等。这些方法都需要加热设备培养微生物，并且微生物法耗时很长，无法快速检测。针对农药残留，还有乙酰胆碱酯酶抑制法，但是这个方法只能半定量检测样品中的农药残留总量，无法精确定量，也无法区分残留农药的具体种类。因此，迫切需要发展一种灵敏、准确、快速并且可同时检测多种农药和兽药的检测方法。目前，国内外现有的研究主要集中于针对单一农兽药建立其特异性免疫检测方法，而实际上农产品中残留的农兽药往往同时会有多种，单一农兽药免疫检测方法及相应的试剂盒已经难以满足实际检测的需要了。生物芯片技术是20世纪90年代在生命科学领域迅速兴起的一项高新技术。生物芯片已经在疾病诊断、药物筛选、农作物育种、司法鉴定等领域有着广泛应用。它具有微型化、高通量和自动化的检测特征。开发高通量、快速、准确的可同时定量检测多种农兽药残留的微阵列芯片具有重要意义。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术的第一目的是提供一种同时检测多种农兽药残留的化学发光微阵列生物芯片，本专利技术的第二目的是提供利用上述生物芯片同时检测多种农兽药残留的方法，在于弥补现有农药、兽药同时定量检测技术的空白，满足对动物源性食品、植物源性食品中多种药物残留同时进行快速检测的要求，具有多靶标、成本低、灵敏度高、检测时间短和操作简单易行等特点。技术方案：本专利技术提供的一种基于化学发光的可同时检测多种农兽药残留的生物芯片，所述生物芯片包括固定有一组检测目标物抗原的芯片载体，所述检测目标物为农药和/或兽药，所述生物芯片由以下方法制成：以牛血清白蛋白为空白对照，将牛血清白蛋白和检测目标物抗原通过生物芯片制备系统在芯片载体上点样操作后，于20-37℃水浴中孵育0.5-4h，洗涤后晾干即得。优选的，所述牛血清白蛋白和检测目标物抗原均使用CB缓冲液稀释，所述CB缓冲液配方：称取3.03gNa2CO3和6.00gNaHCO3，用蒸馏水溶解并定容至500～2000mL。所述洗涤采用PBS缓冲液，洗涤3次，每次200～300μL。所述生物芯片为一组由检测目标物抗原的矩阵组成，所述矩阵的列数为3的倍数，将矩阵设的列数设为3的倍数，从而每个检测目标物抗原可点3个重复点，使测定结果更直观更准确。所述的芯片载体为24孔板、96孔板、384孔板、透明高聚物片基、膜或玻片。所述的农药为有机氯类农药、有机磷类农药、拟除虫菊酯类农药、氨基甲酸酯类农药、烟碱类农药、甲草胺、乙草胺、百草枯、异菌脲中的任意一种或几种；所述的兽药为抗生素类、促生长类药物中的任意一种或几种。进一步的，所述的有机氯类农药包括滴滴涕、六六六、三氯杀螨砜、三氯杀螨醇、五氯硝基苯、百菌清、道丰宁、氯丹、七氯、艾试剂、毒杀芬、冰片基氯；所述的有机磷类农药包括乐果、氧化乐果、对硫磷、三唑磷、内吸磷、甲基内吸磷、马拉硫磷、敌百虫、敌敌畏、甲拌磷、乙拌磷、甲基对硫磷、磷胺、硫特普、二溴磷、氯蜱硫磷；所述的拟除虫菊酯类农药包括甲氰菊酯、氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、二氯苯醚菊酯；所述的氨基甲酸酯类农药包括多菌灵、速本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于化学发光的可同时检测多种农兽药残留的生物芯片，其特征在于：所述生物芯片包括固定有一组检测目标物抗原的芯片载体，所述检测目标物为农药和/或兽药，所述生物芯片由以下方法制成：以牛血清白蛋白为空白对照，将牛血清白蛋白和检测目标物抗原通过生物芯片制备系统在芯片载体上点样操作后，于20‑37℃水浴中孵育0.5‑4h，洗涤后晾干即得。

【技术特征摘要】
1.一种基于化学发光的可同时检测多种农兽药残留的生物芯片，其特征在于：所述生物芯片包括固定有一组检测目标物抗原的芯片载体，所述检测目标物为农药和/或兽药，所述生物芯片由以下方法制成：以牛血清白蛋白为空白对照，将牛血清白蛋白和检测目标物抗原通过生物芯片制备系统在芯片载体上点样操作后，于20-37℃水浴中孵育0.5-4h，洗涤后晾干即得。2.根据权利要求1所述的一种基于化学发光的可同时检测多种农兽药残留的生物芯片，其特征在于，所述牛血清白蛋白和检测目标物抗原均使用CB缓冲液稀释，所述CB缓冲液配方：称取3.03gNa2CO3和6.00gNaHCO3，用蒸馏水溶解并定容至500～2000mL。3.根据权利要求1所述的一种基于化学发光的可同时检测多种农兽药残留的生物芯片，其特征在于，所述生物芯片为一组由检测目标物抗原的矩阵组成，所述矩阵的列数为3的倍数。所述的芯片载体为24孔板、96孔板、384孔板、透明高聚物片基、膜或玻片。4.根据权利要求1所述的一种基于化学发光的可同时检测多种农兽药残留的生物芯片，其特征在于，所述的农药为有机氯类农药、有机磷类农药、拟除虫菊酯类农药、氨基甲酸酯类农药、烟碱类农药、甲草胺、乙草胺、百草枯、异菌脲中的任意一种或几种；所述的兽药为抗生素类、促生长类药物中的任意一种或几种。5.一种利用权利要求1所述生物芯片同时检测农兽药残留的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)在生物芯片的部分反应孔内分别加入含有不同浓度梯度的检测目标物的混合标准溶液，在剩余反应孔内分别加入待测样品溶液，继续向所有反应孔中依次加入有标记物标记后的检测目标物所对应的抗体，于20～37℃水浴反应10～20min，洗涤液洗涤；(2)向步骤(1)洗涤后的所有反应孔内继续加入显色剂；(3)使用CCD进行图像采...

【专利技术属性】
技术研发人员：李钟卉，李周敏，
申请(专利权)人：南京祥中生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32