本发明专利技术公开了一种检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，旨在提供一种检测方法简单，特异性强，准确度高，重复性好的硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的检测方法；其方案是这样的：1)采用DS酶将硫酸乙酰肝素成品中的硫酸皮肤素降解为DS双糖的溶液；2)制备不同浓度梯度的DS标准品溶液，分别经过DS酶酶解后再分别取样注入高效液相色谱仪中检测各个梯度的DS的双糖峰面积，绘制DS工作曲线；3)用高效液相色谱方法检测步骤1)降解后样品溶液中DS双糖，并且计算DS含量；4)用高效液相色谱方法检测定DS+HS的峰面积，计算DS+HS的含量；5)计算HS含量；属于化学检测技术领域。
【技术实现步骤摘要】
一种检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法
本专利技术涉及检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，属于化学检测
技术介绍
硫酸乙酰肝素(HeparinSulfate，简称HS)是一类广泛存在于动物组织基质及细胞膜的糖胺聚糖，其糖链由N～乙酰氨基葡糖胺通过α～(1～4)～糖苷键与葡糖醛酸或艾杜糖醛酸连接构成二糖单元，硫酸乙酰肝素成品中除主成分硫酸乙酰肝素外，还伴有少量的硫酸皮肤素(DermatanSulfate，DS)等杂质，由于硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素的性质相近，很难直接用液相方法分离开来，甚至在美国药典肝素钠色谱鉴别仪器色谱条件下硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素在同一出峰时间出峰，故无法直接测定硫酸乙酰肝素的含量。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的是提供一种检测方法简单，特异性强，准确度高，重复性好的硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的检测方法。为此，本专利技术提供的方案是这样的：一种检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，依次包括下述步骤：1)采用DS酶将硫酸乙酰肝素成品中的硫酸皮肤素降解为DS双糖的溶液；2)制备不同浓度梯度的DS标准品溶液，分别经过DS酶酶解后再分别取样注入高效液相色谱仪中检测各个梯度的DS的双糖峰面积，绘制DS工作曲线；3)用高效液相色谱方法检测步骤1)降解后样品溶液中DS双糖，并且计算DS含量；4)用高效液相色谱方法检测定DS+HS的峰面积，计算DS+HS的含量；5)计算HS含量。优选的，上述的检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，步骤1)硫酸皮肤素降解为DS双糖的方法是：将硫酸乙酰肝素成品溶于Tris-HCl缓冲液，配制成2mg/ml的硫酸乙酰肝素母液，取2μl母液到50mMTris-HCl缓冲液中稀释成0.5ml，置于1.5ml离心管中，加入1IU的DS酶，在37℃水浴条件下温育酶解24h，接着100℃煮沸使酶失活，最后0.22μm微孔滤膜过滤除菌。优选的，上述的检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，步骤2)具体方法是：取DS标准品溶于Tris-HCl缓冲液，配制成1mg/ml的DS母液，取母液0μl、1μl、3μl、6μl、9μl和12μl，分别溶于Tris-HCl缓冲液稀释成0.5ml，置于1.5ml离心管中，作为一系列浓度梯度的标准溶液；再在各管分别加入1IU的DS酶，在37℃水浴条件下温育酶解24h，接着100℃煮沸使酶失活，最后0.22μm微孔滤膜过滤除菌，得到一系列待检测标准溶液；再将各个浓度的标准溶液分别注入高效液相色谱仪检测，将检测到的前3个主要的DS双糖峰的峰面积相加，采用峰面积之和对DS双糖浓度作图，得到方程式和相关系数。优选的，上述的检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，所述的50mMTris-HCl缓冲液，含10mMCaCl2，pH7.0。优选的，上述的检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，所述的高效液色谱条件为：色谱柱：WatersSpherisorbS5-SAX，4.6mm×250mm×5μm；流速1.40ml/min；波长为234nm，柱温：40℃，进样量50μl；流动相A是pH3.0的磷酸二氢钠溶液，流动相B是pH3.0的高氯酸钠和磷酸二氢钠溶液；梯度洗脱程序：0～2min，97％A、3％B；2～26min，97％～62％A、3％～38％B；26～30min，62～20％A、38～80％B；30～34min，20～97％A、80～3％B。优选的，上述的的检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，所述的流动相A的制备方法为：称取820mg的磷酸二氢钠溶于约1900ml的纯水中，用磷酸调节pH到3.0，加水至2000ml，用0.22μm的滤膜过滤；所述的流动相B制备方法为：称取139g的一水合高氯酸钠和410mg的磷酸二氢钠，溶于约900ml的纯水中，用磷酸调节pH到3.0，加水至1000ml，用0.22μm的滤膜过滤。优选的，上述的的检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，步骤3)具体步骤为：取硫酸乙酰肝素母液，采用HPLC检测条件检测该样品，将检测到的峰面积相加，然后用步骤2)得到的工作曲线计算出DS浓度，即为硫酸乙酰肝素中的DS含量。优选的，上述的检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，用高效液相色谱方法检测定DS+HS的总色谱峰峰面积的方法为：1)标准溶液配制2mg/ml的HS标准溶液的配制：精密称取20mgHS标准品至10ml容量瓶，用纯水溶解并定容；2)样品处理硫酸乙酰肝素成品25mg/ml待检测样品溶液：称取250mg样品于10ml容量瓶中，用纯水溶解并定容；4)将处理后的待检测样品溶液注入高效液相色谱仪，所述的色谱条件：色谱柱：戴安分析柱：IonPacAS11-HC4×250mm；戴安保护柱：IonPacAG11-HC4×50mm；流速0.50ml/min；波长为202nm，柱温：40℃，进样量20μl；流动相A和流动相B与权利要求6所述的流动相相同；梯度洗脱程序：0～10min，75％A、25％B；10～35min，75％～0％A、25％～100％B；35～40min，0～0％A、100～100％B；40～41min，0～75％A、100～25％B；41～60min，75～75％A、25～25％B。优选的，上述的检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，所述HS含量计算方法为：HS％＝(HS+DS)％-DS％；式中：(HS+DS)％＝0.08×A测试样品/AHS标准×100％A测试样品为202nm条件下，3次测试待检测样品溶液中HS+DS峰的峰面积的平均值；AHS标准为202nm条件下，前3针HS标准溶液中主峰面积的平均值；DS％为根据DS工作曲线计算所得到的数据。与现有技术相比，本专利技术提供的技术方案具有如下技术优点：本专利技术提供的首先使用DS酶将硫酸乙酰肝素成品中的硫酸皮肤素充分降解为以DS双糖为主的片段，用高效液相方法检测降解物中的DS双糖，计算峰面积和，采用外标法在标准曲线上读出样品的硫酸皮肤素含量，然后根据样品中的HS和DS在适当的离子色谱条件下同时出峰的特性测出样品的(DS+HS)的含量，最后再将该含量扣除DS含量从而得到样品的HS含量；检测方法简单，特异性强，准确度高，重复性好。附图说明图1是DS酶解后的双糖色谱图；图2是DS工作曲线；图3是HS+DS的含量图谱。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术的权利要求做进一步的详细说明。需要说明的是，本申请所检测的所有含量均为质量百分含量。一、检测DS质量百分含量原理：以硫酸软骨素酶B(DS酶)为工具，特异性地将硫酸乙酰肝素中的硫酸皮肤素充分降解为以DS双糖为主的片段，用高效液相法检测样品DS的双糖峰面积，从而计算出硫酸皮肤素的含量。1.1、样品的DS双糖取100mg某批号硫酸乙酰肝素成品，溶于50mlTris-HCl缓冲液(50mM，含10mMCaCl2，pH7.0)，配制成2mg/ml的硫酸乙酰肝素母液，取2μl母液到50mMTris-HCl缓冲液中稀释成0.5ml，置于1.5ml离心管中，加入1IU的DS酶，在37℃水浴条件下温育酶解24h，接着100摄氏度煮沸使酶失活，最后0.22um微孔滤膜过滤除菌。1.2、工作曲线所需的DS双本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，其特征在于，依次包括下述步骤：1)采用DS酶将硫酸乙酰肝素成品中的硫酸皮肤素降解为DS双糖的溶液；2)制备不同浓度梯度的DS标准品溶液，分别经过DS酶酶解后再分别取样注入高效液相色谱仪中检测各个梯度的DS的双糖峰面积，绘制DS工作曲线；3)用高效液相色谱方法检测步骤1)降解后样品溶液中DS双糖，并且计算DS含量；4)用高效液相色谱方法检测定DS+HS的峰面积，计算DS+HS的含量；5)计算HS含量。
【技术特征摘要】
1.一种检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，其特征在于，依次包括下述步骤：1)采用DS酶将硫酸乙酰肝素成品中的硫酸皮肤素降解为DS双糖的溶液；2)制备不同浓度梯度的DS标准品溶液，分别经过DS酶酶解后再分别取样注入高效液相色谱仪中检测各个梯度的DS的双糖峰面积，绘制DS工作曲线；3)用高效液相色谱方法检测步骤1)降解后样品溶液中DS双糖，并且计算DS含量；4)用高效液相色谱方法检测定DS+HS的峰面积，计算DS+HS的含量；5)计算HS含量。2.根据权利要求1所述的检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，其特征在于，步骤1)硫酸皮肤素降解为DS双糖的方法是：将硫酸乙酰肝素成品溶于Tris-HCl缓冲液，配制成0.1-20mg/ml的硫酸乙酰肝素母液，取母液到Tris-HCl缓冲液中后稀释,加入DS酶充分降解，在30-45℃水浴条件下温育酶解12-36h，接着煮沸使酶失活，最后微孔滤膜过滤除菌。3.根据权利要求1所述的检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，其特征在于，步骤2)具体方法是：取DS标准品溶于Tris-HCl缓冲液，配制成1mg/ml的DS母液，取母液0μl、1μl、3μl、6μl、9μl和12μl，分别溶于Tris-HCl缓冲液稀释成0.5ml，置于1.5ml离心管中，作为一系列浓度梯度的标准溶液；再在各管分别加入1IU的DS酶，在30-45℃水浴条件下温育酶解12-36h，接着煮沸使酶失活，最后0.22μm微孔滤膜过滤除菌，得到一系列待检测标准溶液；再将各个浓度的标准溶液分别注入高效液相色谱仪检测，将检测到的前3个DS双糖峰的峰面积相加，采用峰面积之和对DS双糖浓度作图，得到方程式和相关系数。4.根据权利要求2或3所述的检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，其特征在于，所述的50mMTris-HCl缓冲液，含10mMCaCl2，pH7.0。5.根据权利要求3所述的检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，其特征在于，所述的高效液色谱条件为：色谱柱：WatersSpherisorbS5-SAX，4.6mm×250mm×5μm；流速1.40ml/min；波长为234nm，柱温：40℃，进样量50μl；流动相A是pH3.0的磷酸二氢钠溶液，流动相B是pH3.0的高氯酸钠和磷酸二氢钠溶液；梯度洗脱程序：0～2min，97％A、3％B；2～26min，97％～62％A、3％～38％B；26～30min，62...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄洪，陈海苑，
申请(专利权)人：深圳市格利科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44
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