一种木薯腋芽体细胞胚胎离体培养脱毒苗的培养方法技术

本发明专利技术提供了一种木薯腋芽体细胞胚胎离体培养脱毒苗的培养方法，包括以下步骤：预培养：取感染ACMV的木薯嫩茎经常规表面消毒后切取带腋芽茎段或未脱毒完全‑感染病毒试管苗的带腋芽茎段，接种到腋芽膨大诱导培养基上进行暗培养3‑7天；体细胞胚胎诱导培养：剥离经培养后膨大的腋芽，接种于体细胞胚胎诱导培养基上进行暗培养25‑35天；体细胞胚胎成熟培养：将体细胞胚胎组织块接种到体细胞胚成熟培养基上进行光照培养25‑35天；植株再生培养：将成熟体细胞胚胎组织块接种到植株再生培养基上进行光照培养28‑40天。本发明专利技术脱毒效率和繁殖系数高，外植体材料多，操作简易，速度快，再生植株数量多，苗生根率高，长势健壮。

A method for culture of virus-free seedlings of cassava axillary bud somatic embryos in vitro

The present invention provides a method for culturing virus-free seedlings of cassava axillary bud somatic embryos in vitro, which includes the following steps: pre-culture: after routine surface disinfection of cassava tender stem infected with ACMV, the stem segments with axillary bud or the stem segments with axillary bud or virus-free fully infected test-tube seedlings were cut and inoculated on the axillary bud swelling induction medium for dark culture for 3 to 7 days; Culture: stripping axillary buds and inoculating them on somatic embryo induction medium for dark culture for 25 to 35 days; somatic embryo maturation culture: inoculating somatic embryo tissue blocks onto somatic embryo maturation medium for 25 to 35 days; plant regeneration culture: inoculating mature somatic embryo tissue blocks onto plant regeneration medium for 28 days 40 days. The invention has high virus-free efficiency and reproductive coefficient, many explant materials, simple operation, fast speed, large number of regenerated plants, high rooting rate and strong growth.

【技术实现步骤摘要】
一种木薯腋芽体细胞胚胎离体培养脱毒苗的培养方法
本专利技术涉及一种木薯腋芽体细胞胚胎离体培养脱毒苗的培养方法。
技术介绍
木薯(ManihotesculentaCrantz)是大戟科(Euphorbiaceae)植物，染色体数为2n＝36，多年生灌木，高1-5m。木薯是仅次于水稻、玉米、高粱的第四大热带作物，其块根含有丰富的淀粉，既可作粮食，也可作为工业原料或饲料，是热带、亚热带地区6亿人的主要粮食来源。木薯起源于南美，于16-18世纪传入非洲、亚洲及大洋洲。现在木薯已广泛地分布于全球的热带及部分亚热带地区。木薯于1820年前由东南亚华侨引入我国，至今已有180多年的栽培历史。目前我国木薯产区包括海南、广东、广西、福建、云南等省区，四川、贵州、湖南、江西等地也有种植，现有栽培面积50余万公顷，鲜薯产量1000万吨。木薯主要的优点是具有很高的产量潜力。它是一种C3-C4中间型作物，在适宜的条件下具有很高的光合作用效率，而在干旱和高温的胁迫下，也能保持较高的光合效率。木薯花叶病是木薯最重要病毒之一，往往会导致木薯产量损失50％以上，严重的可超过80％，严重威胁木薯产业的发展。对以木薯为主要食物的热带地区低收入农户来说，不仅极大的影响了木薯种植的经济效益，更会严重威胁种植户的食物来源，造成极其严重的后果。木薯花叶病由许多不同种的双生病毒科(Geminiviridae)引起，目前已经鉴定的病毒有7种，包括非洲木薯花叶病毒(Africancassavamosaicvirus,ACMV)、东非木薯花叶病毒(EastAfricancassavamosaicCameroonvirus)、东非木薯花叶喀麦隆病毒(EastAfricancassavamosaicCameroonvirus)、东非木薯花叶肯尼亚病毒(EastAfricancassavamosaicKenyavirus)、东非木薯花叶马拉维病毒(EastAfricancassavamosaicMalawivirus)、东非木薯花叶桑给巴尔病毒(EastAfricancassavamosaicZanzibarvirus)和南非木薯花叶病(SouthAfricancassavamosaicvirus)。木薯花叶病毒可通过嫁接、汁液接种、种茎及昆虫介体传播，开始是在叶片上显现出褪绿的斑点，然后逐步扩大并和周围的正常绿色组织混成一片，最后形成典型的花叶，严重时可导致木薯整株死亡，造成极大的经济损失。由于长期采用无性繁殖，木薯产量下降、品质下降、种性退化，母株一旦感染木薯花叶病毒，病毒在木薯体内传染，并逐代累积。通过现有的方法生产出的组培苗仍然携带病毒，移栽后极易引起木薯花叶病大面积发生，造成难以估量的损失，也严重影响了木薯的推广。目前，脱毒苗的生产一般选用植物的茎尖生长点作为外植体，通过加大培养代数获得脱毒苗。如中国专利技术专利CN103202232A，根据病毒在植株顶端生长点的数量远远少于植株下部成熟部位的原理，加大取生长点代数，达到脱毒的目的。但是上述获得脱毒苗的方法，需进行多代取生长点进行组织培养，培养周期长，脱毒苗繁殖效率低，影响了脱毒苗的大规模推广，也极大的阻碍着优质木薯种质资源的引进和交流。尤其是涉及到从木薯花叶病毒大规模爆发的疫区引进木薯种质资源的过程中，快速地培育脱毒种苗成了引种的关键因素之一。此外，茎尖的生长点不仅长度小，而且十分幼嫩，在剥离的过程中，难以快速寻找到准确的位点，而且剥离和转移过程中极易破碎和损伤，操作十分困难，不仅浪费材料，而且难以进行大规模生产。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中不足，提供一种高效的木薯腋芽体细胞胚胎离体培养脱毒苗的培养方法，利用木薯腋芽为外植体诱导体细胞胚胎离体培养获得脱毒苗，该方法脱毒效率和繁殖系数高，外植体材料多，操作简易，速度快，数量多，苗生根率高，更健壮。本专利技术的第一个方面是提供一种木薯腋芽体细胞胚胎离体培养脱毒苗的培养方法，包括以下步骤：步骤1，预培养：取感染ACMV的木薯的嫩茎经常规表面消毒后切取带腋芽茎段或未脱毒完全-感染病毒试管苗的带腋芽茎段，接种到腋芽膨大诱导培养基上进行暗培养3-7天直至腋芽膨大；步骤2，体细胞胚胎诱导培养：剥离经培养后膨大的腋芽，接种于体细胞胚胎诱导培养基上进行暗培养25-35天；步骤3，体细胞胚胎成熟培养：将体细胞胚胎组织块接种到体细胞胚成熟培养基上进行光照培养25-35天；步骤4，植株再生培养：将成熟体细胞胚胎组织块接种到植株再生培养基上进行光照培养28-40天。其中，所述腋芽膨大诱导培养基为添加5-20mg/L6-BA的MS培养基，6-BA的的添加量可以为例如5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、11mg/L、12mg/L、13mg/L、14mg/L、15mg/L、16mg/L、17mg/L、18mg/L、19mg/L或20mg/L等。优选地，所述腋芽膨大诱导培养基中6-BA的浓度为10-20mg/L。其中，所述体细胞胚胎诱导培养基在MS培养基中添加有0.2-0.8mg/LCuSO4和5-15mg/L氨氯吡啶酸。CuSO4的添加量可以为例如0.2mg/L、0.25mg/L、0.3mg/L、0.35mg/L、0.4mg/L、0.45mg/L、0.5mg/L、0.55mg/L、0.6mg/L、0.65mg/L、0.7mg/L、0.75mg/L、或0.8mg/L等。氨氯吡啶酸的添加量可以为例如5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、11mg/L、12mg/L、13mg/L、14mg/L、或15mg/L等。优选地，所述体细胞胚胎诱导培养基中氨氯吡啶酸的浓度为10-15mg/L。其中，所述体细胞胚成熟培养基为在MS培养基中添加有0.2-0.8mg/LCuSO4、0-0.1mg/L6-BA和15-25g/L蔗糖。CuSO4的添加量可以为例如0.2mg/L、0.25mg/L、0.3mg/L、0.35mg/L、0.4mg/L、0.45mg/L、0.5mg/L、0.55mg/L、0.6mg/L、0.65mg/L、0.7mg/L、0.75mg/L、或0.8mg/L等。蔗糖的添加量可以为例如15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L、或25g/L等。6-BA的添加量可以为例如0、0.01mg/L、0.02mg/L、0.03mg/L、0.04mg/L、0.05mg/L、0.06mg/L、0.07mg/L、0.08mg/L、0.09mg/L或0.1mg/L等。优选地，所述体细胞胚成熟培养基中6-BA的浓度为0.01-0.05mg/L。其中，所述植株再生培养基为在MS培养基中添加有0.005-0.02mg/L6-BA、0.01-0.03mg/LGA3、0.01-0.03mg/LNAA和15-20g/L蔗糖。蔗糖的添加量可以为例如15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L、或25g/L等。6-BA的添加量可以为例如0.005mg/L、0.007mg/L、0.008mg本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种木薯腋芽体细胞胚胎离体培养脱毒苗的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，预培养：取感染ACMV的木薯的嫩茎经常规表面消毒后切取带腋芽茎段或未脱毒完全‑感染病毒试管苗的带腋芽茎段，接种到腋芽膨大诱导培养基上进行暗培养3‑7天直至腋芽膨大，所述腋芽膨大诱导培养基为添加5‑20mg/L6‑BA的MS培养基；步骤2，体细胞胚胎诱导培养：剥离经培养后膨大的腋芽，接种于体细胞胚胎诱导培养基上进行暗培养25‑35天，所述体细胞胚胎诱导培养基为在MS培养基中添加有0.2‑0.8mg/LCuSO4和5‑15mg/L氨氯吡啶酸；步骤3，体细胞胚胎成熟培养：将体细胞胚胎组织块接种到体细胞胚成熟培养基上进行光照培养25‑35天，所述体细胞胚成熟培养基为在MS培养基中添加有0.2‑0.8mg/LCuSO4、0‑0.1mg/L6‑BA和15‑25g/L蔗糖；步骤4，植株再生培养：将成熟体细胞胚胎组织块接种到植株再生培养基上进行光照培养28‑40天，所述植株再生培养基为在MS基础培养基中添加有0.005‑0.02mg/L6‑BA、0.01‑0.03mg/LGA3、0.01‑0.03mg/LNAA和15‑20g/L蔗糖。...

【技术特征摘要】
1.一种木薯腋芽体细胞胚胎离体培养脱毒苗的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，预培养：取感染ACMV的木薯的嫩茎经常规表面消毒后切取带腋芽茎段或未脱毒完全-感染病毒试管苗的带腋芽茎段，接种到腋芽膨大诱导培养基上进行暗培养3-7天直至腋芽膨大，所述腋芽膨大诱导培养基为添加5-20mg/L6-BA的MS培养基；步骤2，体细胞胚胎诱导培养：剥离经培养后膨大的腋芽，接种于体细胞胚胎诱导培养基上进行暗培养25-35天，所述体细胞胚胎诱导培养基为在MS培养基中添加有0.2-0.8mg/LCuSO4和5-15mg/L氨氯吡啶酸；步骤3，体细胞胚胎成熟培养：将体细胞胚胎组织块接种到体细胞胚成熟培养基上进行光照培养25-35天，所述体细胞胚成熟培养基为在MS培养基中添加有0.2-0.8mg/LCuSO4、0-0.1mg/L6-BA和15-25g/L蔗糖；步骤4，植株再生培养：将成熟体细胞胚胎组织块接种到植株再生培养基上进行光照培养28-40天，所述植株再生培养基为在MS基础培养基中添加有0.005-0.02mg/L6-BA、0.01-0.03mg/LGA3、0.01-0.03mg/LNAA和15-20g/L蔗糖。2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述腋芽膨大诱导培养基中6-BA的浓度为10-20mg/L。3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述体细胞胚胎诱导培养基中氨氯吡啶酸的浓度为10-15mg/L。4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述体细胞胚成熟培养基中6-BA的浓度为0.01...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱文丽，陈松笔，李开绵，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，
类型：发明
国别省市：海南,46