一种环境雌激素对家蚕发育毒性测试方法技术

本发明专利技术公开了一种环境雌激素对家蚕发育毒性测试方法，包括以下步骤：首先是采用口腔灌胃注射含有一系列浓度的受试物于饥饿处理2h的5龄期家蚕幼虫；20min后对灌胃的家蚕解剖取组织器官。毒性终点包括家蚕中肠中谷胱甘肽还原酶活性系数、抗超氧阴离子自由基活力。通过染毒组与对照组的毒性终点比较，确定该受试物对家蚕发育的毒性。研究环境雌激素4‑壬基酚对家蚕幼虫期中肠发育的影响，以确定其对家蚕幼虫期发育毒性的剂量－效应关系。采用本发明专利技术技术方案，能对环境雌激素壬基酚产生多个生物效应终点，评价家蚕暴露在雌激素环境浓度水平下存在的潜在风险，是一种相对快速、简便、灵敏的检测方法。

【技术实现步骤摘要】
一种环境雌激素对家蚕发育毒性测试方法
本专利技术涉及生物领域，具体涉及一种环境雌激素对家蚕发育毒性测试方法。
技术介绍
环境激素是广泛存在于自然界，对无脊椎和脊椎动物表现雌激素效应的人工合成化学物质。壬基酚（Nonylphenol，NP）是已经被证明具有雌激素效应的物质。NP在工、农业生产过程中得到广泛应用，在常温下稳定，不易被降解。近年来，在我国太湖、松花江流域等许多江河湖泊中都检测出NP。在自来水、牛奶、动植物等生物体内也检测出NP。NP可经多种途径进入生物体内，并具有生物蓄积性。NP的永久性质和亲脂性导致其易积聚在动物组织中，在许多动物体内发现它的急性和慢性毒性影响。低浓度的环境雌激素对动物的危害在短期内很难观察到，往往需要长时间暴露才能显示出严重后果。国内外学者已就NP对陆生动物、水生动物的机体结构及生理生化效应等方面的影响作了较多的研究工作。其中，抗氧化防御系统作为污染物胁迫的生物标志物的研究，正在成为分子生态毒理学、动物毒理学和环境毒理学领域中新的热点。家蚕是鳞翅目模式昆虫，已经被广泛用于各类研究。家蚕的生理特征能够代表鳞翅目等一大类群生物。家蚕容易获得并易于在实验室内饲养和繁殖，进行遗传学分析及多种实验操作也更方便。在个体大小方面家蚕具有比果蝇更好的可操作性，还具有比线虫更加复杂的遗传和发育调控机制。具备了环境毒理学实验动物必须的基础。实验室条件下裔洪根等（2008）用家蚕全龄期添食4-壬基酚（4-NP），调查发现4-NP对家蚕的生殖细胞数量、生殖细胞的生长和发育、雌蛾造卵数和产出卵数有一定的关联性。袁红霞等（2013）调查发现4-NP对家蚕的生长发育毒性与家蚕幼虫的生长速度、生长量、发育整齐度、生命力等变化有一定的关联性。综合相关文献，4-NP对家蚕的毒性实验中，都是采用家蚕全龄期添食4-NP的方法，持续25-30天左右。这种全龄期添食4-NP染毒方法，耗时较长，对家蚕的饲养操作有一定的困难。因此，快速鉴别4-NP对家蚕的发育毒性是一项迫切需要解决的技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的问题，提供一种环境雌激素对家蚕发育毒性测试方法。为了实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本专利技术通过以下技术方案实现：一种环境雌激素对家蚕发育毒性测试方法，包括以下步骤：（1）配制壬基酚母液，并将其置于4℃冰箱避光保存备用；（2）将壬基酚母液用稀释液稀释成三组不同的浓度：0.02、0.20、2.0g/L，置于4℃冰箱避光保存；（3）将实验分为四组，包括步骤（2）所述的三种壬基酚浓度的染毒组和空白对照组，每组又设制3个重复组，每组设制15头家蚕，将家蚕饥饿处理2h后，用100μL平头微量注射器吸取每组溶剂，针头探入蚕口腔注射给药100μL；20min后，在超净工作台上进行处理，解剖取中肠，中肠置于冰冷的生理盐水中清洗后装EP管，-20℃保存；（4）将步骤（3）已取好的中肠组织块制备中肠组织匀浆；（5）将步骤（4）制得的中肠组织匀浆4℃离心，取上清液后分别测定谷胱甘肽还原酶活性系数（GRAC）以及抗超氧阴离子活力；（6）数据处理：将实验数据采用SPSS16.0forWindows软件对染毒组与对照组的中肠组织的谷胱甘肽还原酶活性系数和抗超氧阴离子活力进行显著性分析。进一步的，所述步骤（1）中配制壬基酚母液的具体方法为：首先称取1176mg的壬基酚溶于50mL的无水乙醇中，配制成20g/L的壬基酚溶液，将此溶液用0.22μm微孔滤膜过滤后，作为壬基酚母液转入试剂瓶用膜封口后置于4℃冰箱避光保存。进一步的，所述步骤（2）中的稀释液为超纯水和无水乙醇的混合溶液，经稀释后的每组壬基酚溶液中的无水乙醇的体积分数均为10%。进一步的，所述步骤（4）中制备中肠组织匀浆的具体步骤为：将已取好的中肠组织块在冰冷的生理盐水中漂洗，除去其中的血液和丝腺等杂质，滤纸拭干；准确称取中肠组织重量，放入事先灭好菌并冷藏的研钵中，加入液氮研磨，研磨充分后加入组织块重量9倍的预冷0.9%生理盐水制成10倍中肠组织匀浆。进一步的，所述步骤（5）中的离心转速为3500r/min，离心时间为10min。优选的，所述的壬基酚为4-壬基酚。有益效果：本专利技术提供了一种环境雌激素对家蚕发育毒性测试方法，采用本专利技术的测试方法，能对环境雌激素壬基酚产生多个生物效应终点，评价家蚕暴露在雌激素环境浓度水平下存在的潜在风险，是一种相对快速、简便、灵敏的检测方法。附图说明图1是本专利技术检测4-NP对家蚕幼虫中肠组织GRAC的影响示意图。图2是本专利技术检测4-NP对家蚕幼虫中肠组织抗超氧阴离子活力的影响示意图。具体实施方式下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本专利技术。一种环境雌激素对家蚕发育毒性测试方法，包括以下步骤：步骤1）首先称取1176mg的4-NP溶于50ml的无水乙醇中，配制成20g/L的4-NP溶液，将此溶液用0.22μm微孔滤膜过滤后，作为4-NP母液转入试剂瓶用膜封口后置于4℃冰箱避光保存；步骤2）实验时，取出上述母液，待恢复到室温并充分摇匀后，用超纯水和无水乙醇配制浓度为0.02、0.20、2.0g/L的4-NP暴露溶液各100ml，使得每组无水乙醇浓度都为10%，试剂瓶用膜封口后置于4℃冰箱避光保存；步骤3）实验分四组（包括空白对照组），染毒组和对照组均设制3组重复，每组共15头家蚕。将蚕饥饿处理2h后，用100μL平头微量注射器吸取4-NP溶液，针头探入蚕口腔注射给药100μL；20min后，在超净工作台上进行处理，解剖取中肠；中肠置于冰冷的生理盐水中清洗后装EP管，-20℃保存；步骤4）将已取好的中肠组织块在冰冷的生理盐水中漂洗，除去其中的血液和丝腺等杂质，滤纸拭干；准确称取中肠组织重量，放入事先灭好菌并冷藏的研钵中，加入液氮研磨，研磨充分后加入组织块重量9倍的预冷0.9%生理盐水制成10倍中肠组织匀浆；步骤5）中肠组织匀浆4℃离心（3500r/min，10min），取上清液分别测定谷胱甘肽还原酶活性系数以及抗超氧阴离子活力。具体步骤按照南京建成生物工程研究所谷胱甘肽还原酶活性系数（GRAC）测定试剂盒说明书和抗超氧阴离子活力测试盒说明书操作。测试结果如下：4-NP对家蚕幼虫中肠组织GRAC的影响：如图1所示，对照组中家蚕中肠组织GRAC平均值在3.45。不同浓度4-NP（0.02~2.00g/L）处理后，各处理组家蚕中肠组织GRAC明显低于对照组（P＜0.01），但不同浓度4-NP处理组之间没有显著差异（P＞0.05）。说明4-NP处理后中肠组织中GR活性升高，加速氧化型谷胱甘肽转化为还原型谷胱甘肽，也暗示4-NP使中肠组织细胞产生活性氧自由基，中肠组织细胞处于高还原和应激状态，有利于机体抗氧化和保护作用。壬基酚对家蚕幼虫中肠组织抗超氧阴离子活力的影响：如图2所示，对照组中家蚕幼虫中肠组织抗超氧阴离子活力为236.24g/L。不同浓度4-NP（0.02~2.00g/L）处理后，家蚕中肠组织抗超氧阴离子活力明显低于对照组，4-NP处理后中肠组织抗超氧阴离子自由基活力的降低，较对照下降了4.73~28.91%，差异极其显著（P＜0.01）。说明4-NP处理后，中肠组织中•O2-的生成超过了本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种环境雌激素对家蚕发育毒性测试方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）配制壬基酚母液，并将其置于4℃冰箱避光保存备用；（2）将壬基酚母液用稀释液稀释成三组不同的浓度：0.02、0.20、2.0 g/L，置于4℃冰箱避光保存；（3）将实验分为四组，包括步骤（2）所述的三种壬基酚浓度的染毒组和空白对照组，每组又设制3个重复组，每组设制15头家蚕，将家蚕饥饿处理2h后，用100 μL平头微量注射器吸取每组溶剂，针头探入蚕口腔注射给药100 μL；20 min后，在超净工作台上进行处理，解剖取中肠，中肠置于冰冷的生理盐水中清洗后装EP管，‑20℃保存；（4）将步骤（3）已取好的中肠组织块制备中肠组织匀浆；（5）将步骤（4）制得的中肠组织匀浆4℃离心，取上清液后分别测定谷胱甘肽还原酶活性系数以及抗超氧阴离子活力；（6）数据处理：将实验数据采用SPSS16.0 for Windows软件对染毒组与对照组中肠组织的谷胱甘肽还原酶活性系数和抗超氧阴离子活力进行显著性分析。

【技术特征摘要】
1.一种环境雌激素对家蚕发育毒性测试方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）配制壬基酚母液，并将其置于4℃冰箱避光保存备用；（2）将壬基酚母液用稀释液稀释成三组不同的浓度：0.02、0.20、2.0g/L，置于4℃冰箱避光保存；（3）将实验分为四组，包括步骤（2）所述的三种壬基酚浓度的染毒组和空白对照组，每组又设制3个重复组，每组设制15头家蚕，将家蚕饥饿处理2h后，用100μL平头微量注射器吸取每组溶剂，针头探入蚕口腔注射给药100μL；20min后，在超净工作台上进行处理，解剖取中肠，中肠置于冰冷的生理盐水中清洗后装EP管，-20℃保存；（4）将步骤（3）已取好的中肠组织块制备中肠组织匀浆；（5）将步骤（4）制得的中肠组织匀浆4℃离心，取上清液后分别测定谷胱甘肽还原酶活性系数以及抗超氧阴离子活力；（6）数据处理：将实验数据采用SPSS16.0forWindows软件对染毒组与对照组中肠组织的谷胱甘肽还原酶活性系数和抗超氧阴离子活力进行显著性分析。2.根据权利要求1所述的一种环境雌激素对家蚕发育毒性测试方法，其特征在于，所述步骤（1）中配制壬基酚母液的具...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁红霞，秦粉菊，
申请(专利权)人：苏州科技大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32