用于粪便样本筛查碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌（CRE）的试剂盒及筛查方法技术

本发明专利技术公开了用于粪便样本筛查碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌（CRE）的试剂盒及筛查碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌(CRE)的方法。试剂盒包含：粪便肉汤增菌液5ml：包含0.5wt％的氯化钠，0.5wt％酵母粉，1wt％的植物蛋白胨，基质为无菌水，PH为7.0，已经过121℃高压灭菌15min；含药平板：含美罗培南的中国兰平板，美罗培南的浓度为0.3ug/m。本发明专利技术采用2步法进行筛查，先第一次增菌获得耐药菌，第二次用药板筛选获得耐药单菌落。该方法使用方便，大大减少了真菌等杂菌的干扰，筛选阳性率高，可以在临床实验室广泛的应用，满足临床对CRE快速诊断的需求。

【技术实现步骤摘要】
用于粪便样本筛查碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌(CRE)的试剂盒及筛查方法
本方法属于分子生物学和医学微生物
，尤其涉及一种用于粪便样本筛查碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌(CRE)的试剂盒及筛查方法。
技术介绍
自2001年美国报道第1株产KPC型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌以来，产KPC酶的肠杆菌科细菌在全世界各个国家和地区报道，甚至在以色列、希腊、意大利和部分南美洲国家等引起流行或爆发流行。这其中碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌(Carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)尤为突出。我国CHINET细菌耐药性监测的历年数据显示，肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素的耐药率逐年增高，尤其是肺炎克雷伯菌，其对碳青霉烯类抗生素的耐药率已从2005年的3％以下骤升至2017年的20％左右，并且全国各个地区CRKP分离率各不相同，2017年最新监测数据显示分离率最高为河南省，高达53.01％；浙江省排名第三，分离率为36.79％。而碳青霉烯类耐药大肠埃希菌、阴沟肠杆菌复合群和弗劳地柠檬酸杆菌的从2005年至2017年分离率都较为稳定，碳青霉烯类耐药大肠埃希菌为1.0％左右，碳青霉烯类耐药阴沟肠杆菌复合群为5.0％左右，碳青霉烯类耐药弗劳地柠檬酸杆菌为10.0％左右。产碳青霉烯酶导致的耐药：肠杆菌科细菌中主要产A类和D类丝氨酸酶，部分菌株产生B类金属酶。丝氨酸酶的共同特点是在其活性部位具有丝氨酸残基，其中A类酶可以水解青霉素类、头孢菌素类碳青霉烯类和氨曲南，主要基因型有blaKPC、blaIMI和blaGES等，在CRKP中以blaKPC-2型最为常见。D类酶可水解苯唑西林、氯唑西林和碳青霉烯类抗生素，又称之为OXA型β-内酰胺酶，该类酶在不动杆菌中普遍存在，而在肠杆菌科细菌中较为少见，不同菌属中OXA的型别也不同。B类碳青霉烯酶为金属β-内酰胺酶，该类酶的特点是可以水解除单酰胺环类(如氨曲南)以外的所有β-内酰胺类抗菌药物。代表基因型有blaNDM、blaVIM和blaIMP，在CRE中的大肠埃希菌和阴沟肠杆菌复合体中以blaNDM-1基因型最为常见。针对CRE对临床抗感染治疗带来的严峻挑战，各国都给予了广泛关注，全世界范围内医学界为应对CRE带来的感染问题，均提出了相应的感染预防与控制措施，最大程度上制止多重耐药菌的产生及传播。欧洲疾病预防和控制中心强调了感染风险的重要性，将如下4点列为“风险”因素：在过去12个月内有在医疗机构过夜；过去12个月有长期透析史或化疗史；过去12个月有CRE携带史；与CRE携带者有明确流行病学联系。其主张对考虑存有风险的个体提前采取医疗隔离及接触预防措施，同时积极进行CRE的筛查，且CRE阳性患者需进行额外的治疗隔离措施。WHO则直接给出了8点CRE的预防和控制措施：多模式感染预防控制策略的实施；重视手卫生；无症状CRE定植菌的监测；重视接触预防措施；重视病人的医疗隔离；环境的清洁；环境中CRE定植或污染的检测培养；及时的检测、审核和反馈。因此，对CRE的主动筛查势在必行。目前文献报道对粪便中CRE的筛查方法最常见的是美国CDC推荐的方法，即采样厄他培南纸片加入5ml的肉汤，挑取适量的粪便，培南18-20小时，次日转种到麦康凯或者中国兰平板，根据平板上菌落生长来获得CRE，该方法操作相对简单，但是存在的问题是由于粪便中有大量的细菌和真菌，在抗菌药物厄他培南存在的情况下，真菌对该抗生素天然耐药，因此大量生长。从而相对抑制了CRE的生长。因此本专利技术选择第一代无抗生素的增菌，第二代采样有抗生素平板筛选，使得粪便携带较少CRE的情况下也能筛选出阳性样本，为临床实验室提供一种方便快捷、阳性率高的筛选肠道CRE的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足和缺陷，提供一种从粪便样本筛查碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌(CRE)的方法，以大大提高粪便样本筛选CRE的阳性率。本专利技术采用如下技术方案：一种用于从粪便样本筛查碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌(CRE)的试剂盒，包含：试剂1：粪便肉汤增菌液5ml：包含0.5wt％的氯化钠，0.5wt％酵母粉，1wt％的植物蛋白胨，基质为无菌水，PH为7.0，已经过121℃高压灭菌15min；试剂2：含药平板：含美罗培南的中国兰平板，美罗培南的浓度为0.3ug/ml。所述含药平板的使用效期为一周，即从含药平板配制完成后一周内有效。一种从粪便样本筛查碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌(CRE)的方法，包括如下步骤：步骤1：取粪便加入试剂1，35℃培养箱增菌8-12小时。步骤2：用接种环挑取增菌后的肉汤一环，接种到试剂2，继续放35℃培养箱培养8-12小时。步骤3：根据试剂2上生长的菌落，判断是否存在CRE。本方法与现有技术相比，具有如下有益效果：(1)本方法首先采用肉汤增菌方法，扩增了碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌(CRE)的菌量，根据真菌生长慢于细菌的特性，使得耐药菌的生长速度快于真菌，在采用二次抗生素药板筛选，获得耐药菌株，减少真菌干扰，提高阳性率。(2)本方法可方便快捷的在不同等级的医院使用，为临床筛查CRE提供有效方法。附图说明图1含药平板上生长结果；图2KB法药敏试验的验证结果。具体实施方式结合实施例对本方法作进一步说明，取200份新入院患者的粪便，进行实验：实施例1(肉汤增菌法)1样本第一次接种增菌：用棉签挑取适量粪便(约火柴头大小)接种到5ml粪便增菌肉汤，35℃孵箱中孵育8-12h。2、样本第二次含药平板筛选：将第一次肉汤增菌后的增菌液挑取一环接种到0.3ug/ml美罗培南的中国兰平板上，35℃孵箱中孵育8-12h。3、含药平板上生长的菌落，判断是否存在CRE，通过以下方法：3.1细菌鉴定：挑取含药平板上的单个菌落均匀涂布于质谱专用靶板上，待干燥后加1μl基质液覆盖靶点自然风干待用。将靶板放入质谱仪中，开始鉴定过程，图谱数据采集后与质谱数据库进行比对。3.2药敏实验：采用K-B纸片扩散法测定长肠杆菌细菌对碳青霉烯类抗生素厄他培南、美罗培南和亚胺培南药敏纸片的抑菌环直径，孵育过夜(18-24h)。判定结果参照美国临床和实验室标准化委员会(CLSI)推荐的折点。3.3耐药基因的检测：对耐药菌株采用聚合酶链反应(PCR)进行临床常见碳青霉烯耐药基因的检测(KPC、NDM、IMP、VIM和OXA)，反应条件参见文献报道。实施例2(CDC方法)1样本接种：用棉签挑取适量粪便(约火柴头大小)接种到5ml粪便增菌肉汤，加入一片厄他培南纸片(10ug/ml),35℃孵箱中孵育8-12h。2、增菌液转划：将第一次含药肉汤增菌后的增菌液挑取一环接种到临床常用中国兰平板上(本实施例的中国兰平板不含美罗培南)，35℃孵箱中孵育8-12h。3、含药平板上生长的菌落，判断是否存在CRE，通过以下方法：3.1细菌鉴定：挑取含药平板上的单个菌落均匀涂布于质谱专用靶板上，待干燥后加1μl基质液覆盖靶点自然风干待用。将靶板放入质谱仪中，开始鉴定过程，图谱数据采集后与质谱数据库进行比对。3.2药敏实验：采用K-B纸片扩散法测定长肠杆菌细菌对碳青霉烯类抗生素厄他培南、美罗培南和亚胺培南药敏纸片的抑菌环直径，孵育过夜(18-24h)。判定结果参照美国临床和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于从粪便样本筛查碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌(CRE)的试剂盒，其特征在于，包含：试剂1：粪便肉汤增菌液5ml：包含0.5wt％的氯化钠，0.5wt％酵母粉，1wt％的植物蛋白胨，基质为无菌水，PH为7.0，已经过121℃高压灭菌15min；试剂2：含药平板：含美罗培南的中国兰平板，美罗培南的浓度为0.3ug/ml。所述含药平板的使用效期为一周，即从含药平板配制完成后一周内有效。

【技术特征摘要】
1.一种用于从粪便样本筛查碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌(CRE)的试剂盒，其特征在于，包含：试剂1：粪便肉汤增菌液5ml：包含0.5wt％的氯化钠，0.5wt％酵母粉，1wt％的植物蛋白胨，基质为无菌水，PH为7.0，已经过121℃高压灭菌15min；试剂2：含药平板：含美罗培南的中国兰平板，美罗培南的浓度为0.3ug/ml。所述含药平板...

【专利技术属性】
技术研发人员：王汉宇，李佳萍，黄子衔，胡洁，孙巧玲，舒玲斌，张嵘，
申请(专利权)人：王汉宇，
类型：发明
国别省市：浙江,33