本发明专利技术公开了一种利用热解糖高温厌氧菌和产琥珀酸放线杆菌混菌发酵生产丁二酸的方法，包括以下步骤：（1）将活化的热解糖高温厌氧菌接种到含有木聚糖的发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；（2）将活化的琥珀酸放线杆菌接种到步骤（1）得到的发酵液中，发酵生产丁二酸。当热解糖高温厌氧菌M5培养了48 h时加入产琥珀酸放线杆菌菌泥，丁二酸产量最高，达到43.10 g/L，该方法是目前利用木聚糖为唯一碳源时混菌发酵得到的最高丁二酸产量，降低了工业生产丁二酸的底物成本，具有重要的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
一种利用热解糖高温厌氧菌和产琥珀酸放线杆菌混菌发酵生产丁二酸的方法
本专利技术属于微生物发酵领域，具体涉及一种利用热解糖高温厌氧菌和产琥珀酸放线杆菌混菌发酵生产丁二酸的方法。
技术介绍
丁二酸（又名琥珀酸），是一种重要的四碳平台化合物，广泛应用于食品、塑料、医药、香料等工业。此外，丁二酸还是合成可降解塑料的主要原料，它可以与丁二醇、乙二醇、丙二醇等缩合聚合生产聚丁二酸丁二醇酯、聚乙二醇丁二酸酯、聚丙二醇丁二酸酯等具有优良特性且可完全被生物降解的高分子材料，是丁二酸潜在的最具发展前景的领域。美国能源部2004年公布的12种最有潜力大宗产品中，丁二酸排在第一位。目前商品化的丁二酸主要是以顺丁烯二酸、顺丁烯二酸酐等石油基材料为原料通过催化加氢或电化学合成，其过程中伴随大量温室气体及有毒废弃物的排放，对环境污染严重。随着石油资源供应日益紧张以及环境意识的日益增强，化学法合成逐渐受到限制，不利于丁二酸相关产业的发展。而微生物发酵法生产丁二酸具有以可再生的生物质资源为原料、发酵条件温和、可固定CO2等一系列优点，成为近年来国内外的研究热点之一。在众多产丁二酸的微生物中，产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillussuccinogenes）以其产量高（最高可达110g/L）、耐受性（最高可耐160g/L葡萄糖）等优点，是目前最具发展前景的生产菌种之一。但目前微生物发酵法生产丁二酸的生产成本偏高，影响了其产业化的进程。采用廉价或废弃的非粮生物质资源替代葡萄糖进行丁二酸生产，不仅是对废弃的生物质资源再利用，而且可以有效降低丁二酸生产原料成本，对促进丁二酸生物发酵法生产具有重要的意义。谷物秸秆中的主要成分为纤维素和半纤维素，其中半纤维素的主要组分为木聚糖，能以木聚糖为唯一碳源生产丁二酸可以大大降低生产成本，并且还可以变废为宝。嗜热厌氧杆菌是可以通过一体化生物加工工程直接利用半纤维素为碳源进行发酵的嗜热型野生菌株。CN106995790A公开了一株能够直接利用木质纤维素为碳源的热解糖高温厌氧菌株M5（Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum），其可以高效降解木质纤维素。混菌发酵是指采用两种或多种微生物的协同作用共同完成某发酵过程的一种新型发酵技术。是纯种发酵技术的新发展，也是一种不需要进行复杂的DNA体外重组却可取得类似效果的新型发酵技术。优点是可提高发酵效率甚至可形成新产品。根据生物间的结合方式，可分如下四型。（1）联合发酵：用两种或多种微生物同时接种和培养，例如我国专利技术的维生素C生产中山梨糖转化为二酮基古龙酸过程中的混菌发酵。（2）顺序发酵:先用甲菌进行常规发酵，再由乙菌等按顺序进行发酵，以共同完成数个生化反应，例如少根根霉(Rhizopusarhizus)先把葡萄糖转化为反丁烯二酸，然后再由产气肠杆菌(Enterococcusaerogenes)或普通变形杆菌(Proteusvulgaris)将它还原为发酵产物琥珀酸。（3）共固定化细胞混菌发酵：把两种或多种微生物细胞同时包埋或吸附于同一载体上而进行的混菌发酵，例如黑曲霉(Aspergillusniger)和运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)共同把淀粉转化为酒精等；（4）混合固定化细胞混菌发酵：将两种或多种微生物细胞分别固定化后，再把它们混在一起进行混菌发酵。产琥珀酸放线杆菌不能够利用淀粉和纤维素等多糖类物质，但其可利用单糖作为碳源，如木糖，进行丁二酸的高效生产。而热解糖高温厌氧菌株可以将木聚糖等半纤维素高效降解成木糖。将热解糖高温厌氧菌株和产琥珀酸放线杆菌进行混菌发酵，可以实现利用木聚糖高效生产丁二酸的目标。目前还没有利用木质纤维素混菌生产丁二酸的报道。
技术实现思路
专利技术目的：为了解决传统丁二酸发酵方法以粮食或其他淀粉质副产品为原料生产成本过高的问题，本专利技术提供了一种利用热解糖高温厌氧菌和产琥珀酸放线杆菌混菌发酵生产丁二酸的方法。技术方案：本专利技术所述一种利用热解糖高温厌氧菌和产琥珀酸放线杆菌混菌发酵生产丁二酸的方法，包括以下步骤：（1）将活化的热解糖高温厌氧菌接种到含有木聚糖的发酵培养基中进行发酵，发酵24~120小时，得到发酵液；（2）将活化的产琥珀酸放线杆菌接种到步骤（1）得到的发酵液中，混菌发酵生产丁二酸。优选地，步骤（1）所述发酵时间优选为24~72h，更进一步地优选为发酵48小时，将活化的产琥珀酸放线杆菌接种到步骤（1）得到的发酵液中。此时发酵液中有一定量木糖，且木聚糖酶和木二糖酶的活性最高，能够连续降解木聚糖为木糖，而产琥珀酸放线杆菌可以利用降解得到的木糖生产丁二酸。接种时间过早（M5发酵少于24h），木聚糖酶的酶活较低，不利用后续木聚糖的降解；接种时间过晚（M5发酵72h-120h），则会导致菌株M5培养时间过长，木聚糖酶和木二糖酶分泌量减少，而先前分泌出的酶在55℃下的酶活下降，从而导致酶系的酶活下降，且部分降解得到的木糖也被菌株M5利用，从而减少了产琥珀酸放线杆菌的碳流量，最终导致丁二酸产量降低。因此，产琥珀酸放线杆菌的接种时间是混菌发酵生产丁二酸极为关键的步骤。步骤（1）所述活化的热解糖高温厌氧菌的接种量为发酵培养基体积的1-10%；所述含有木聚糖的发酵培养基配方为：0.5-2.0g/LNaCl，0.5-2.0g/LK2HPO4，0.5-2.0g/LKH2PO4，1.0-5.0g/L酵母粉，1.0-3.0g/L玉米浆干粉，0.2-1.0g/LMgCl2·6H2O，0.1-0.6g/LNH4Cl，0.01-0.05g/LCaCl2·2H2O，0.5-2.0g/LFeCl2·4H2O，0.1-0.5g/LKCl，木聚糖30-90g/L，溶剂为水，调节pH至6.0-6.5，通二氧化碳10-20min，121℃灭菌15min；所述发酵条件为：发酵温度50-65℃，发酵时间为36-72h，发酵pH为5.5-8.5（每隔12-24h调节pH），转速0-120rpm，可静置发酵，也可搅拌发酵。优选地，所述含有木聚糖的发酵培养基中木聚糖浓度为60g/L。优选地，步骤（1）所述发酵条件为：发酵温度55℃，发酵时间48h，发酵pH为7.5，转速120rpm。所述热解糖高温厌氧菌的活化培养基配方为0.5-2.0g/LNaCl，0.5-2.0g/LK2HPO4，0.5-2.0g/LKH2PO4，1.0-5.0g/L酵母粉，1.0-3.0g/L玉米浆干粉，0.2-1.0g/LMgCl2·6H2O，0.1-0.6g/LNH4Cl，0.01-0.05g/LCaCl2·2H2O，0.5-2.0g/LFeCl2·4H2O，0.1-0.5g/LKCl，木聚糖30-90g/L，溶剂为水，调节pH至6.0-6.5；活化条件为：将热解糖高温厌氧菌以接种量5%v/v接种到活化培养基中，50-65℃、0-120rpm活化48-96h，每隔12h调节pH至5.5-8.5。其中，热解糖高温厌氧菌（Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum），菌株号为M5，已保存于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年2月27日，保藏号为CCTCCNO:M2017072，保藏地址为：中国.武汉.武本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种利用热解糖高温厌氧菌和产琥珀酸放线杆菌混菌发酵生产丁二酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将活化的热解糖高温厌氧菌接种到含有木聚糖的发酵培养基中进行发酵，发酵24~120小时；（2）将活化的产琥珀酸放线杆菌接种到步骤（1）的发酵液中，发酵生产丁二酸。
【技术特征摘要】
1.一种利用热解糖高温厌氧菌和产琥珀酸放线杆菌混菌发酵生产丁二酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将活化的热解糖高温厌氧菌接种到含有木聚糖的发酵培养基中进行发酵，发酵24~120小时；（2）将活化的产琥珀酸放线杆菌接种到步骤（1）的发酵液中，发酵生产丁二酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述热解糖高温厌氧菌分类命名为热解糖高温厌氧菌（Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum），菌株号为M5，步骤（2）所述产琥珀酸放线杆菌分类命名为产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillussuccinogenes），菌株号为130Z。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述热解糖高温厌氧菌发酵48小时，将步骤（2）活化的产琥珀酸放线杆菌接种到步骤（1）得到的发酵液中，发酵生产丁二酸。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述活化的热解糖高温厌氧菌的接种量为发酵培养基体积的1-10%。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述发酵条件为：发酵温度50-65℃，发酵pH为5.5-8.5，转速0-120rpm。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述含有木聚糖的发酵培养基配方为：0.5-2.0g/LNaCl，0.5-2.0g/LK2HPO4，0.5-2.0g/LKH2PO4，1.0-5.0g/L酵母粉，1.0-3.0g/L玉米浆干粉，0.2-1.0g/LMgCl2·6H2O，0.1-0.6g/LNH4Cl，0.01-0.05g/LCaCl2·2H2O，0.5-2.0g/LFeCl2·4H2O，0.1-0.5g/LKCl，木聚糖30-90g/L，溶剂为水，调节pH至5.5-8.5。7....
【专利技术属性】
技术研发人员：信丰学，陆家声，姜岷，蒋羽佳，董维亮，章文明，方艳，马江锋，周杰，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。