溶藻弧菌干粉化LAMP快速检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了溶藻弧菌干粉化LAMP快速检测试剂盒，该试剂盒由干粉化检测试剂、复溶液、阳性对照干粉、阴性对照干粉、封闭液、显色液和裂解液组成，以上7种试剂分别置于容器中。应用于本试剂盒中的引物对应溶藻弧菌特异性基因序列的8个区段，6条引物，并且通过加入显色液，阴阳性显色差异明显，具有特异性强、灵敏度高、易于操作、结果判断简单等优点，适合于食品安全和医药卫生领域中的溶藻弧菌快速检测。另外，本发明专利技术为干粉化的检测试剂，便于常温运输，且使用简单、快捷，无需专门仪器，降低成本并拓宽产品应用范围，更适用于现场及偏远地区基层对溶藻弧菌的快速检测，具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
溶藻弧菌干粉化LAMP快速检测试剂盒
本专利技术涉及微生物分子生物学检测试剂，具体涉及一种基于LAMP技术的干粉化溶藻弧菌核酸快速检测试剂盒。
技术介绍
溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)作为一种嗜盐性的革兰氏阴性菌，大面积分布于海洋环境中，并且广泛寄生于大量海洋生物体内，其在侵染、增殖等过程中会产生相关毒素，破坏宿主体内正常新陈代谢，造成宿主组织、细胞等严重损伤，甚至是死亡。在水产养殖中，溶藻弧菌是引发各种鱼类、虾蟹、贝类以及甲壳类等致病、死亡的主要条件致病菌，其疫情大面积爆发直接给该养殖行业造成不可估量的经济损失。另外，人体会由于进食被溶藻弧菌污染的水产品而感染，造成急性胃肠炎、外耳炎、中耳炎、伤口创面感染，甚至是败血症等病症，严重威胁其身心健康。因此，在生产生活中，尤其是水产品相关的微生物检测中，溶藻弧菌属于日常监测、检疫的重点对象。目前，水产养殖行业一般通过广泛使用抗生素来控制溶藻弧菌疫情，这样会导致严重的菌株耐药性，其危害也会加剧。虽然当前已建立了多种溶藻弧菌检测方法，主要包括采用传统培养基法(病原微生物分离鉴定、形态学鉴定及自动化鉴定方法)、酶联免疫技术、核酸探针技术、核酸扩增(PCR)技术等，但这些方法表现出检测周期长、操作复杂、仪器昂贵以及成本高等不足，并且多局限在实验室检测，难以满足在基层现场的快速检测需求。可见，寻求一种能够快速、准确地鉴定出溶藻弧菌的方法具有重要的意义。目前国内主要以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化鉴定和血清学分型鉴定等通行方法进行食品微生物学相关检验，其初步鉴定一般需要2～3天，而最终完成鉴定报告则需10～15天。整个检测过程十分漫长，难以满足快速检测的需要。LAMP技术是由Notomi等人于2000年开发的一种新型的体外恒温扩增特异核酸片段的技术。该技术利用两对特殊引物和具有链置换活性的BstDNA聚合酶。使反应中在模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，在恒温条件下使引物顺利与模板结合并进行链置换扩增反应，与常规PCR相比，无需反复变温、电泳判读等过程，在灵敏度、特异性和检测范围等技术指标上能媲美甚至高于PCR技术，而不依赖专门的仪器可以实现现场的快速检测，其成本远低于荧光定量PCR。LAMP引物设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因6个区域设计的4条特殊引物，并增加2条靶向扩增反应中形成的环状结构的环引物。在引物设计时候，应注意以下问题：在靶点的选择上为特异基因的保守序列，靶序列长度超过500bp会显著降低LAMP的扩增效率，最佳靶序列长度应为150bp～180bp；引物的GC含量在40～65％；对于GC含量丰富的序列，引物区的Tm值控制在60℃～65℃，AT含量丰富的序列，引物区的Tm值则控制在55℃～60℃；为了保持引物末端的稳定性，其末端稳定性自由能(ΔG)值小于-4kcal/mol；引物设计应避免出现二级结构；环引物的加入可以把原来的LAMP反应缩短一半左右，但在引物设计中，其设计区域常常因为序列区间长度不够无法用软件生成，因此会出现只有1条环引物或没有环引物序列符合条件，此时通过标记设计区域进行手动设计；引物的设计满足以上条件的一般为5～10套，实际扩增效果仍然需要通过反应扩增的各种参数，如灵敏度、指数增长期的起始时间、扩增产物量等，如果只采用单一引物组，不能保证所选的引物能够进行高效扩增。在非实验室的条件下利用LAMP技术进行快速检测，检测前都要配制相应的反应体系溶液，容易导致由于多次操作引起的误差，且易造成实验区间的交叉污染，检测所需的部分试剂需要冷冻储存，不适合高温长途运输，尤其是BstDNA聚合酶，需要在-20℃条件下保存，不宜反复冻融，以免影响酶活，因此会增加试剂的运输成本。目前该检测方法尚未在食品安全、医药卫生等领域推广开来，且作为非标方法，目前已有的LAMP产品仅仅针对检测流程，涉及到样品前处理的方法和方式均无提及，加之市场上基于LAMP技术的溶藻弧菌快速检测试剂盒较少，且能用于常温运输的干粉型同类产品尚未出现。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有溶藻弧菌的传统致病微生物检测技术以及其相关产品制备工艺的不足，提供一种基于LAMP技术可常温运输的干粉化溶藻弧菌快速检测试剂盒。本专利技术所采取的技术方案是：一种溶藻弧菌的LAMP引物组，包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP以及环引物LF/LB，其序列如下：溶藻弧菌-F3：atgcgtcatgcactgctattatc溶藻弧菌-B3：tcgtagcggctagcgaagctag溶藻弧菌-FIP：gtcgactgcgcgtgacggtgcgctccgcaatatggatcatcg溶藻弧菌-BIP：tgcagctgtgcgtgcgagtgagtagagcgagcttcgctgtctc溶藻弧菌-LF：atgctgctgacgtgtctgcag溶藻弧菌-LB：gtcgagtgctgctgatcgtcgg。一种溶藻弧菌的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其LAMP引物组如上所示。作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，检测试剂盒包括复溶液、阳性对照干粉、阴性对照干粉、显色液、裂解液、封闭液和干粉化的检测试剂。作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，干粉化的检测试剂冻干前的组成为：0.7～2.0mmol/LdNTPs、0.3～0.5U/μLBstDNA聚合酶、0.1～0.8μmol/L外引物F3/B3、1.2～2.0μmol/L内引物FIP/BIP、0.6～1.8μmol/L环引物LF/LB、100～400μmol/LMnCl2以及含3％～6％海藻糖(w/v)、0.01％～0.1％甘氨酸(w/v)、0.1％～1％牛血清白蛋白的冻干复合保护剂，余量为无菌超纯水。作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，复溶液含有：1～1.2mmol/LMgSO4、5～15mmol/LKCl、10～25mmol/LTris-HCl、5～15mmol/L(NH4)2SO4、0.1～0.5％TritonX-100以及0.3～2.0mol/L甜菜碱。作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，显色液为10～85μmol/L钙黄绿素。作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，裂解液含有：5～35mmol/LTris-HCl，pH8.3、0.5～1.5mmol/LEDTA以及0.2～1.3％SDS。作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，封闭液为无菌石蜡油。作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，阳性对照为提纯的溶藻弧菌基因组DNA制成的冻干粉，阴性对照为提纯的非溶藻弧菌基因组DNA制成的冻干粉。作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，其使用方法包括如下步骤：1)参照SN/T2754.12-2011《出口食品中致病菌环介导恒温扩增(LAMP)检测方法第12部分：溶藻弧菌》，根据NMKLNo.156进行样品制备和增菌，接种20g食品样品于200mL3％氯化钠碱性蛋白胨水中，36±1℃进行增菌10±2h；2)取以上增菌液1～2mL经6000r/min离心，去上清；3)分别向(2)中离心得到沉淀中加入裂解液，充分悬浮，99℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种溶藻弧菌的LAMP引物组，包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP以及环引物LF/LB，其特征在于：其序列如下：溶藻弧菌‑F3：atgcgtcatgcactgctattatc溶藻弧菌‑B3：tcgtagcggctagcgaagctag溶藻弧菌‑FIP：gtcgactgcgcgtgacggtgcgctccgcaatatggatcatcg溶藻弧菌‑BIP：tgcagctgtgcgtgcgagtgagtagagcgagcttcgctgtctc溶藻弧菌‑LF：atgctgctgacgtgtctgcag溶藻弧菌‑LB：gtcgagtgctgctgatcgtcgg。

【技术特征摘要】
1.一种溶藻弧菌的LAMP引物组，包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP以及环引物LF/LB，其特征在于：其序列如下：溶藻弧菌-F3：atgcgtcatgcactgctattatc溶藻弧菌-B3：tcgtagcggctagcgaagctag溶藻弧菌-FIP：gtcgactgcgcgtgacggtgcgctccgcaatatggatcatcg溶藻弧菌-BIP：tgcagctgtgcgtgcgagtgagtagagcgagcttcgctgtctc溶藻弧菌-LF：atgctgctgacgtgtctgcag溶藻弧菌-LB：gtcgagtgctgctgatcgtcgg。2.一种溶藻弧菌的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：其LAMP引物组如权利要求1所示。3.根据权利要求2所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：检测试剂盒包括复溶液、阳性对照干粉、阴性对照干粉、显色液、裂解液、封闭液和干粉化的检测试剂。4.根据权利要求3所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：干粉化的检测试剂冻干前的组成为：0.7～2.0mmol/LdNTPs、0.3～0.5U/μLBstDNA聚合酶、0.1～0.8μmol/L外引物F3/B3、1.2～2.0μmol/L内引物FIP/BIP、0.6～1.8μmol/L环引物LF/LB、100～400μmol/LMnCl2以及含3％～6％海藻糖(w/v)、0.01％～0.1％甘氨酸(w/v)、0.1％～1％牛血清白蛋白的冻干复合保护剂，余量为无菌超纯水。5.根据权利要求3或4所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：复溶液含有：1～1.2mmol/LMgSO4、5～15mmol/LKCl、10～25mmol/LTris-HCl、5～15mmol/L(NH4)2SO4、0.1～0.5％TritonX-100以及0.3～2.0mol/...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡芷荷，周杨，万强，卢勉飞，曲晓莹，吴清平，何天文，
申请(专利权)人：广东环凯生物科技有限公司，广东环凯微生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44