用于鉴定铜绿假单胞菌的分子靶标及其定量检测方法技术

本发明专利技术公开了用于铜绿假单胞菌鉴定的分子靶标及其检测方法，属于微生物技术领域

【技术实现步骤摘要】
用于鉴定铜绿假单胞菌的分子靶标及其定量检测方法
[0001]本申请是
CN114107532A(
申请日为
2021
年
12
月
20
日
、
申请号为
2021115607002、
专利技术创造名称为用于鉴定铜绿假单胞菌的分子靶标及其定量检测方法
)
的分案申请
。


[0002]本专利技术属于微生物
，具体涉及用于铜绿假单胞菌鉴定的分子靶标及其检测方法
。

技术介绍

[0003]铜绿假单胞菌俗称绿脓杆菌，在自然界中分布广泛，为淡水和土壤中最常见的细菌种类之一，空气
、
动物皮肤
、
肠道
、
呼吸道等处均可有该菌的存在
。
该菌可产生多种外毒素
、
内毒素等致病因子，可通过水源
、
土壤
、
工器具
、
接触等多种途径传播，并对消毒剂
、
干燥
、
紫外线等理化因素及不良环境有极强的抵抗力，是导致急性肠道疾病和皮肤炎症的完全致病菌
。
近年来该菌对包装饮用水污染的报告数量明显增加，污染情况较为严重
。
早期有研究发现我国市售天然矿泉水铜绿假单胞菌的检出率可达
23.6
％，瓶装饮用纯净水铜绿假单胞菌检出率可达
11.6
％；
2018
年广东省内抽检水样显示，铜绿假单胞菌对包装饮用水和天然矿泉水的污染率达到
8.36
％
(23/275)
；国外污染情况比如德国一项调查在
1.2
％
‑
10.2
％的包装饮用水中检出铜绿假单胞菌阳性，希腊在抽检矿泉水样品发现铜绿假单胞菌污染率达到了
5.9
％
(90/1527)
，澳大利亚的一项检验发下铜绿假单胞菌的污染率水平达了
105CFU/mL。
[0004]此外，铜绿假单胞菌对即食蔬菜和水果的污染问题一直干扰着消费者的健康
。
近些年即食蔬菜因其健康的口碑和而赢得了消费者的青睐，然而即食蔬菜通常成为食源性疾病的一个来源
。
牙买加研究者曾发现是蔬菜在零售市场和超市的蔬菜普遍受到铜绿假单胞菌的污染，来自市场的农产品受到污染的频率更高，并对新鲜蔬菜基质中的铜绿假单胞菌耐药性和毒力因子进行研究，进而发现该菌也是新鲜蔬菜的主要污染物，也可能是社区内易感人群的感染源
。
早期研究发现铜绿假单胞菌对蔬菜沙拉的污染率可以达到
64.5
％，随着卫生水平的改善，在
2015
年有研究者发现铜绿假单胞菌污染番茄或青椒产品的发生率在5％
。
铜绿假单胞菌可以在很多环节对即食蔬菜和水果产生污染，例如，在收获前阶段，铜绿假单胞菌菌种群可以在生长的作物上定居，收获后，通过进一步直接污染或在加工和采后处理过程中现有菌种群的扩散，风险可能会放大
。
被铜绿假单胞菌污染的水源可能是形成链条进入田野污染，包括附近动物牧场的径流和污染源的灌溉
。
铜绿假单胞菌对有机营养要求较低，是生菜西红柿黄瓜等蔬菜水果腐败的优势菌群，严重影响了即食蔬菜水果的运输和储藏
。
如果是摄入铜绿假单胞菌引发感染，健康人需要大于
105cfu/g
的菌浓度，但是即使小于
103cfu/g
的菌浓度也可能会在易感人群肠道内定居，并可能导致胃肠道感染
、
菌血症和血源性传播
。
婴儿也可能出现假单胞菌败血症，表现为有腹泻病史的坏死性肠道病变
。
因此，在食品安全
、
饮用水安全及临床治疗过程中，快速鉴定铜绿假单胞菌并精确定量对预防其污染尤为重要
。
[0005]分子生物学的发展为快速鉴定铜绿假单胞菌提供了方便
。
现行标准
SN/T2206.12
‑
2014《
化妆品微生物检验方法第
12
部分：绿脓杆菌
PCR
法
》
就是把铜绿假单胞菌的外毒素
A
基因保守片段为目标片段，设计
PCR
扩增引物，对化妆品中的铜绿假单胞菌进行快速检测
。
此外，国内外
PCR
检测方法对铜绿假单胞菌分子检测靶标及引物已有一些的报道，常见的特异性基因有
SyrB、toxA、I6S
‑
23S、l6SrDNA、oprl、fliC、ecfX、ecfX+gyrB、ETA、opr、exoU、exoS
等
。
对铜绿假单胞菌的检测方法中，传统培养法是金标准
。
但传统方法中的生化鉴定需要约
48h
增菌，然后进行
24
～
48h
显色培养基培养和进一步的生化鉴定，检验周期大约需要一周或者更长时间，检验步骤繁琐
、
耗时长
。
同时传统方法依据菌株是否产生铜绿色素而判定是否为铜绿假单胞菌的方可能存在漏检或者误检
。
比如我国现行国家标准
GB8538—2016《
食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法
》
中依据产生蓝
/
绿色菌落判定为是铜绿假单胞菌，而在实际中恶臭假单胞菌在相同条件下也产生蓝
/
绿色，因此对可疑菌落产生色素进行判定计数可能出现假阳性；该标准中除了将产蓝
/
绿色
、
产荧光
、
红褐色之外的其他菌落判定为非铜绿假单胞菌，但是研究表明有少许铜绿假单胞菌不产色素，这就有可能出现阳性结果不够准确
。
此外应用生化试验鉴定铜绿假单胞菌，生化反应不稳定，鉴定结果重复性差，也容易造成误判
。
[0006]在实际应用中发现，随着临床治疗过程中铜绿假单胞菌变异菌株和耐药菌株的不断发现，基于原有的以毒力因子为检测靶点建立的分子检测方法因靶点易缺失
、
数量有限导致方法不够准确
。
此外随着全基因组测序技术快速发展及基因库的不断完善，现有的靶标对铜绿假单胞菌菌株的覆盖率不全，导致铜绿假单胞菌分子靶标特异性差
。
靶标数量少
、
特异性差的问题导致在快精准鉴定铜绿假单胞菌面临了很大的挑战
。
因此，寻找新型特异性靶标分子用于铜绿假单胞菌快速
、
精确检测具有重要意义
。
经对现有技术的文献检索，尚未发现有与本专利技术的铜绿假单胞菌特异性新分子靶标及相应的
PCR
和...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
用于铜绿假单胞菌鉴定的分子标记，其特征在于，所述分子标记的序列如
SEQ ID NO.2
所示
。2.
用于鉴别铜绿假单胞菌的引物组，其特征在于，用于检测
SEQ ID NO.2
所示分子标记的引物组的序列如以下引物组合中的任一一种所示：组合一：
SEQ ID NO.7
和
SEQ ID NO.8
，组合二：
SEQ ID NO.15
和
SEQ ID NO.16。3.
一种用于鉴别铜绿假单胞菌的非疾病诊断和治疗目的的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)
使用权利要求2所述引物组中的至少一组对待测样品
DNA
进行
PCR
扩增；
(2)
采用进行凝胶电泳检测扩增产物；
(3)
观察扩增产物是否符合预期
。4.
根据权利要求3所述的用于鉴别铜绿假单胞菌的非疾病诊断和治疗目的的方法，其特征在于，所述
PCR
扩增的扩增体系为：
10
×
PCR
反应缓冲液
2.5
μ
L
，
25mmol/L
，
...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴清平，王楚芳，叶青华，杨宁，陈惠元，刘振杰，张菊梅，吴诗，王涓，丁郁，薛亮，陈谋通，庞锐，
申请(专利权)人：广东环凯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：