阪崎克罗诺杆菌干粉化双重PCR检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了阪崎克罗诺杆菌干粉化双重PCR检测试剂盒，该试剂盒由干粉化检测试剂、复溶液、阳性对照干粉、阴性对照干粉、6×Loading buffer和裂解液组成。本发明专利技术通过比对筛选获取阪崎克罗诺杆菌特异性靶基因16S rDNA和ompA的高度保守区序列，并根据该2段序列分别设计1对PCR扩增引物，同时优化测试得到有效的双重PCR反应体系，经核酸电泳观察结果，较传统检测方法更加简便，具有检测时间短以及特异性好等优点，适用于婴幼儿配方食品、乳和乳制品及其原料中阪崎克罗诺杆菌的检测。本发明专利技术采用干粉化的检测试剂，具有较好的稳定性，使用时即溶即用，操作简便，避免试剂损耗、污染等，并有利于产品储存以及长途运输，为偏远地区的基层检测工作提供便利。

【技术实现步骤摘要】
阪崎克罗诺杆菌干粉化双重PCR检测试剂盒
本专利技术涉及微生物分子检测试剂，具体涉及一种干粉化的阪崎克罗诺杆菌双重PCR检测试剂盒。
技术介绍
阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)是一种革兰氏阴性无芽孢杆菌，其具有周身鞭毛、动力以及产黄色素等特征，属于克罗诺杆菌属(Cronobacter)。阪崎克罗诺杆菌是常见的食源性条件致病菌，已被国际食品微生物标准化委员会(InternationalCommissiononMicrobiologicalSpecificationsforFoods，ICMSF)列为“严重危害特定人群，危害生命或慢性实质性后遗症或长期影响”的一种致病菌，其广泛分布于机体以及自然环境中，主要感染婴幼儿并引发坏死性小肠结肠炎、脑膜炎以及败血症及等严重病症，尤其是对免疫力低下、体重偏低、早产等婴幼儿危害更大，表现出极高的后遗症并发率和死亡率。另外，也有研究显示，该菌还会感染老年人或免疫力低下的成年人群。目前，对阪崎克罗诺杆菌具体致病机制以及污染源等尚不清楚，因此，加强对食品尤其是婴幼儿配方食品、乳和乳制品及其原料中阪崎克罗诺杆菌的监测与控制至关重要。当前，对食品中阪崎克罗诺杆菌的检测检验主要依据美国食药局(FDA)推荐的相关方法，包括传统检测技术(如微生物分离培养鉴定、生化鉴定和血清学鉴定)、免疫学检测技术以及实时荧光定量PCR法等。目前国内主要以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化鉴定和血清学分型鉴定等通行方法进行食品微生物学相关检验，其初步鉴定一般需要2～3天，而最终完成鉴定报告则需5～7天。这些方法表现出检测周期长、操作复杂、仪器昂贵、成本高等不足，并且多局限在实验室检测，难以满足在基层等地区的检测需求。PCR技术发展至今已十分成熟，应用广泛，普通的PCR扩增仪、所需如TaqDNA聚合酶等试剂也在一般实验室中也能得到普及使用，在如GB4789.6-2016食品微生物学检验:致泻大肠埃希氏菌检验和GB4789.12-2016食品微生物学检验:肉毒梭菌及肉毒毒素检验等标准中均也提到可经PCR技术替代相关检测流程，同时针对阪崎克罗诺杆菌的PCR检测方法国内外研究很多，众多有关阪崎克罗诺杆菌的保守性基因也先后被报道，如ompA、cgcA、ITS、16SrDNA和MMS等，这些均为食源性致病微生物的PCR检测奠定了基础。另外，在进行PCR检测时，检测前一般都要配制相应的反应体系溶液，即一般为液体状，其成分较复杂，容易导致由于多次操作引起的误差，且易造成实验区间的交叉污染，加之其中部分主要试剂如TaqDNA聚合酶、dNTPs等需要冷冻储存，而高温长途运输和使用时反复冻融，均会影响其反应效率，同时也增加了储存、运输成本。另外，在相关报道中，一般采用普通单重PCR检测阪崎克罗诺杆菌，其普遍存在特异性差、产物目标条带无法通过根据电泳亮带有效辨别(可能出现非特异性条带与目标条带大小相当)等弊端，而采用有效的多重PCR检测则可大大提高其特异性，并且其产物目标条带更便于观察、识别。但多重PCR相对于单重PCR，其引物设计、筛选的难度也会大大增加，诸如：①用于引物设计的具体DNA片段的选取需有效可行；②不同对引物的退火温度需要相近；③扩增片段大小相差需控制在100～200bp为宜；④多条引物之间需避免非特异性结合；⑤一对引物中的一条不能与其他对的引物一同起作用而产生非特异性扩增。同时多重PCR反应体系也较单重PCR反应体系更为复杂，在其反应体系优化测试中，需逐个测试并兼顾不同反应成分的浓度(如dNTPs、TaqDNA聚合酶以及引物浓度等)，以确保获取更高的扩增效率，期间如遇到多重引物扩增效率不佳，则需重新设计整套多重引物，并再次进行其反应体系优化测试。目前市场上阪崎克罗诺杆菌检测相关的PCR检测试剂盒较少，另外在其PCR检测具体流程、样品前处理方式、检测基因特异性以及检测结果符合率不高等方面尚有不足。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种阪崎克罗诺杆菌干粉化双重PCR检测试剂盒。本专利技术所采取的技术方案是：用于阪崎克罗诺杆菌检测的双重PCR引物组，其序列如下：引物对1：F1：gctaggccccggctagcatgcc和R1：cgctagctagcgtcgcattgtcc引物对2：F2：gctagttcgctcgagcttggcc和R2：tgcgatcgtgctcgtgcccgcg。一种检测阪崎克罗诺杆菌的双重PCR试剂盒，其双重PCR引物组的序列如下：引物对1：F1：gctaggccccggctagcatgcc和R1：cgctagctagcgtcgcattgtcc引物对2：F2：gctagttcgctcgagcttggcc和R2：tgcgatcgtgctcgtgcccgcg。作为上述双重PCR试剂盒的进一步改进，双重PCR试剂盒包括干粉化检测试剂和复溶液，其中：粉化检测试剂的组成为：DNA聚合酶、dNTPs、引物和冻干保护剂。作为上述双重PCR试剂盒的进一步改进，复溶液的组成为：4～16mmol/L(NH4)2SO4、1～15mmol/LMgSO4、10～25mmol/LTris-HCl、5～18mmol/LKCl以及0.5～0.8％TritonX-100。作为上述双重PCR试剂盒的进一步改进，还包括裂解液，裂解液含有：5～30mmol/LTris-HClpH8.5、0.5～1.5mmol/LEDTA以及0.5～1.5％SDS。作为上述双重PCR试剂盒的进一步改进，冻干保护剂的组成为：3～6质量份的海藻糖、0.01～0.1质量份的甘氨酸和0.1～1质量份的牛血清白蛋白。作为上述双重PCR试剂盒的进一步改进，引物对1和引物对2的摩尔用量比为(0.3～1.5)：(0.1～1.2)。作为上述双重PCR试剂盒的进一步改进，干粉化检测试剂冻干前的组成为：0.1～0.6U/μLTaqDNA聚合酶、0.2～1.8mmol/LdNTPs、0.3～1.5μmol/L引物16SrDNA-F/16SrDNA-R、0.1～1.2μmol/L引物ompA-F/ompA-R以及冻干复合保护剂含3％～6％海藻糖(w/v)、0.01％～0.1％甘氨酸(w/v)、0.1％～1％牛血清白蛋白，余量为无菌超纯水。作为上述双重PCR试剂盒的进一步改进，还包括阳性对照和阴性对照，其中，阳性对照干粉为提纯的阪崎克罗诺杆菌基因组DNA冻干粉，阴性对照干粉为提纯的非阪崎克罗诺杆菌基因组DNA冻干粉。作为上述双重PCR试剂盒的进一步改进，干粉化检测试剂的制备方法包括使用液氮预冻，之后冷冻干燥。本专利技术的有益效果是：本专利技术的双重PCR引物，具有很好的特异性和扩增效率。本专利技术的检测试剂盒，具有很好的特异性和扩增效率，从收集DNA样本到检测完成仅需3～4小时，经核酸电泳观察结果，简便，高效快速。本专利技术的检测试剂盒，通过对冻干保护剂进行优化，大大增加试剂稳定性，试剂的保质期时间可以延长到2年，且便于常温运输，节约运输成本，另外在使用时加入预先配置的液态复溶液即溶即用，减少溶液配置步骤，更加便捷、准确，并能有效减少试剂损耗以及气溶胶污染等，更利于长途运输。附图说明图1是本专利技术双重PCR引物扩增后的电泳结果；图2是部分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于阪崎克罗诺杆菌检测的双重PCR引物组，其特征在于：其序列如下：引物对1：F1：gctaggccccggctagcatgcc和R1：cgctagctagcgtcgcattgtcc引物对2：F2：gctagttcgctcgagcttggcc和R2：tgcgatcgtgctcgtgcccgcg。

【技术特征摘要】
1.用于阪崎克罗诺杆菌检测的双重PCR引物组，其特征在于：其序列如下：引物对1：F1：gctaggccccggctagcatgcc和R1：cgctagctagcgtcgcattgtcc引物对2：F2：gctagttcgctcgagcttggcc和R2：tgcgatcgtgctcgtgcccgcg。2.一种检测阪崎克罗诺杆菌的双重PCR试剂盒，其特征在于：其双重PCR引物组的序列如下：引物对1：F1：gctaggccccggctagcatgcc和R1：cgctagctagcgtcgcattgtcc引物对2：F2：gctagttcgctcgagcttggcc和R2：tgcgatcgtgctcgtgcccgcg。3.根据权利要求2所述的双重PCR试剂盒，其特征在于：双重PCR试剂盒包括干粉化检测试剂和复溶液，其中：粉化检测试剂的组成为：DNA聚合酶、dNTPs、引物和冻干保护剂。4.根据权利要求3所述的双重PCR试剂盒，其特征在于：复溶液的组成为：4～16mmol/L(NH4)2SO4、1～15mmol/LMgSO4、10～25mmol/LTris-HCl、5～18mmol/LKCl以及0.5～0.8％TritonX-100。5.根据权利要求3或4所述的双重PCR试剂盒，其特征在于：还包括裂解液，裂解液含有：5～...

【专利技术属性】
技术研发人员：周杨，蔡芷荷，万强，吴清平，卢勉飞，滕昆仑，吕永玲，
申请(专利权)人：广东环凯微生物科技有限公司，广东环凯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44