一种生物被膜态乳酸菌发酵菌剂及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种生物被膜态乳酸菌发酵菌剂及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：制备被膜态的乳酸菌微生物；将被膜态的乳酸菌微生物进行冷冻离心处理，然后进行冷冻干燥处理，制备得到生物被膜态乳酸菌剂。本发明专利技术所制的冻干粉制剂及其制备方法具有耐热能力强，乳酸菌生物被膜态的存活率高出浮游态约在2.3倍。

【技术实现步骤摘要】
一种生物被膜态乳酸菌发酵菌剂及其制备方法
本专利技术属于乳酸菌剂开发
，具体地说，涉及一种生物被膜态乳酸菌发酵菌剂及其制备方法。
技术介绍
乳酸菌广泛存在并应用于发酵食品中，目前因其益生功效，例如改善肠道健康、拮抗病原菌、调节机体代谢、提高免疫力等作用而受到越来越多的关注。然而，由于其生产制备过程中会受到外界不良环境的胁迫，因此开发高耐受力高活力的菌剂产品具有重要意义。生物被膜是细菌利用分泌的多糖，纤维蛋白和脂蛋白等物质将其自身包裹其中，并吸附在生物材料或机体腔道等表面而形成的膜样复合物，是大多数细菌在自然状态下的生活方式，具有浮游状态时不可比拟的优势。由于生物被膜的形成与细菌的毒力、耐药性及群体行为密切相关，所以关于有害微生物生物被膜的研究非常多，也取得了很大的进展。但与此同时，关于乳酸菌生物被膜的研究却相当匮乏，尚处于起步阶段。有研究报道称生物被膜状态下的乳酸菌比浮游状态时具有更显著的免疫调节作用。与常规乳酸菌微制剂相比，生物被膜状态下的乳酸菌微制剂具有更强的抗冷冻干燥能力、耐热性和耐酸性。乳酸菌大致可分为四类：乳酸杆菌，嗜酸乳杆菌，乳酸链球菌以及双歧杆菌，因其能改善肠道菌群和平衡菌群，促进物质的吸收代谢，产生营养物质，抑制病原菌，刺激特异性与非特异性免疫机制等等功效，随着它们的保健作用越来越被消费者理解和接受，市场上乳酸菌制剂形式也越来越多样化，乳酸菌剂的科学研究与发展历程概括来讲有天然乳酸菌发酵剂、传统液体乳酸菌发酵剂、直投式乳酸菌发酵剂。然而，综上所述，现有技术的存在问题是菌剂制备过程中存活率较低，且菌体活性大大降低。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种生物被膜态乳酸菌发酵菌剂及其制备方法，大大提高乳酸菌的抗环境胁迫能力。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种生物被膜态乳酸菌发酵菌剂的制备方法，包括以下步骤：1)制备被膜态的乳酸菌微生物：将乳酸菌生物活化，将乳酸菌微生物取少许菌粉于MRS液体培养基中，振荡培养后与MRS液体培养基转接，将新鲜转接的菌液置于细胞培养板中，充分混合并平铺均匀，于恒温培养箱中静置培养，制备得到被膜态的乳酸菌微生物；2)采用移液枪将每孔底部的被膜态菌体充分吹起，转移至无菌离心管中，冷冻离心，去上清，收集菌泥；将用脱脂乳作为保护剂充分重悬菌泥；后转移至无菌西林瓶中，用无菌纱布封口；3)冷冻干燥处理：将装有脱脂乳菌液的西林瓶和冷冻干燥机配套的铁托盘都放置预冻；后将上述西林瓶放置于铁托盘中，在开启真空冷冻干燥机前先排出仪器中残留水，并先抽真空，待温度降到-30℃以下，将样品放入真空冷冻干燥机，进行冷冻干燥；得到生物被膜态乳酸菌冻干粉发酵菌剂。可选地，所述乳酸菌微生物为LactobacillusplantarumE11。可选地，所述的MRS液体培养基成分为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，柠檬酸二铵2g/L葡萄糖20g/L，硫酸镁MgSO4·7H2O0.58g/L，牛肉浸膏10g/L，磷酸氢二钾K2HPO4·3H2O2g/L，乙酸钠5g/L，吐温801g/L，硫酸锰MnSO44H2O0.25g/L；若为MRS固体培养基加琼脂16g/L。可选地，所述步骤1)中的转接的比例为菌液与MRS液体培养基的体积比为1:100；振荡培养时间为12h；静置培养的温度为37℃，时间为36h。可选地，所述步骤2)中的冷冻离心温度为4℃，时间为5min，转速为5000g。可选地，所述步骤2)中的脱脂乳与菌液的体积比为1:15。可选地，所述步骤3)中的预冻的温度为-80℃；冷冻干燥时间为36h。本专利技术还公开了一种由上述的制备方法制备得到的生物被膜态乳酸菌剂。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：1)本专利技术所制的冻干粉制剂及其制备方法具有耐热能力强，乳酸菌生物被膜态的存活率高出浮游态约在2.3倍。2)如果按照菌液的活菌数在109CFU/mL推算生物被膜态菌体的耐热作用能多保护约106CFU/mL的活菌。3)本专利技术工艺简单、满足标准化生产要求、高浓度、较强发酵能力、易储藏运输保存的优点。具有广阔的市场前景。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1是本专利技术乳酸菌生物被膜态与浮游态耐热性比较；图2是本专利技术乳酸菌生物被膜态与浮游态耐酸性比较；图3是本专利技术乳酸菌被膜态菌体培养照片；图4是本专利技术提供的乳酸菌冻干粉制剂具体形态图。具体实施方式以下将配合实施例来详细说明本专利技术的实施方式，藉此对本专利技术如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。下列实施方法中，如无特殊说明，均为常规方法。下列实施方法中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1植物乳杆菌LL-31被膜态与浮游态的制备配制培养基、0.85％生理盐水、灭菌相应物品、烘干、无菌操作台灭菌。活化LactobacillusplantarumE11(参考文献IsolationofBacteriocinogenicLacticAcidBacteriaforBiopreservationofChineseTraditionalSichuanPickle；Pellicleformation,microbialsuccessionandlacticacidutilisationduringtheaerobicdeterioratingprocessofSichuanpickle)；将LactobacillusplantarumE11取少许菌粉于MRS液体培养基中，振荡培养12h后与培养基按1:100的比例转接，用于生物被膜态和浮游态两种状态的培养。浮游态菌体培养方法如下：将5mL新鲜转接的菌液置于10mL试管中，置于37℃摇床，150rpm振荡培养36h。生物被膜态菌体培养方法如下：将新鲜转接的菌液置于24孔细胞培养板中，充分混合并平铺均匀，每孔1mL，重复5孔，于37℃恒温培养箱静置培养36h。其中，MRS培养基成分表如下表1所示：表1MRS培养基成分表实施例2乳酸菌生物被膜态与浮游态抗胁迫能力的比较：1、平板活菌计数将实施例1中制备的L.plantarumE11生物被膜态和浮游态菌液进行10倍梯度稀释至10-7。稀释方法如下：先将900μL无菌生理盐水置于1.5mL的EP管中，再吸取100μL初始菌液于第一支EP管，即为10-1稀释度，充分混匀后继续吸取100μL液体加入第二支EP管，充分混匀，即为10-2稀释度，重复上述操作直至加到第七支EP管，充分混匀，即为10-7稀释度。选择10-5、10-6、10-7三个稀释梯度液体，取1mL置于空平板中，平行三次，将灭菌后温度在55-65℃的MRS固体培养基缓缓倒入平板中，充分晃匀，避免气泡产生。37℃静置培养24-36h后，计数活菌数，取平均值并记录。结果分析：L.plantarumE11浮游态和被膜态的活菌数如下表所示：表2L.plantarumE11生物被膜态与浮游态平板计数2、乳酸菌生物被膜态与浮游态耐热性测定按照上述方法制备L.plantarum本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生物被膜态乳酸菌发酵菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)制备被膜态的乳酸菌微生物：将乳酸菌生物活化，将乳酸菌微生物取少许菌粉于MRS液体培养基中，振荡培养后与MRS液体培养基转接，将新鲜转接的菌液置于细胞培养板中，充分混合并平铺均匀，于恒温培养箱中静置培养，制备得到被膜态的乳酸菌微生物；2)采用移液枪将每孔底部的被膜态菌体充分吹起，转移至无菌离心管中，冷冻离心，去上清，收集菌泥；将用脱脂乳作为保护剂充分重悬菌泥；后转移至无菌西林瓶中，用无菌纱布封口；3)冷冻干燥处理：将装有脱脂乳菌液的西林瓶和冷冻干燥机配套的铁托盘都放置预冻；后将上述西林瓶放置于铁托盘中，在开启真空冷冻干燥机前先排出仪器中残留水，并先抽真空，待温度降到‑30℃以下，将样品放入真空冷冻干燥机，进行冷冻干燥；得到生物被膜态乳酸菌冻干粉发酵菌剂。

【技术特征摘要】
1.一种生物被膜态乳酸菌发酵菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)制备被膜态的乳酸菌微生物：将乳酸菌生物活化，将乳酸菌微生物取少许菌粉于MRS液体培养基中，振荡培养后与MRS液体培养基转接，将新鲜转接的菌液置于细胞培养板中，充分混合并平铺均匀，于恒温培养箱中静置培养，制备得到被膜态的乳酸菌微生物；2)采用移液枪将每孔底部的被膜态菌体充分吹起，转移至无菌离心管中，冷冻离心，去上清，收集菌泥；将用脱脂乳作为保护剂充分重悬菌泥；后转移至无菌西林瓶中，用无菌纱布封口；3)冷冻干燥处理：将装有脱脂乳菌液的西林瓶和冷冻干燥机配套的铁托盘都放置预冻；后将上述西林瓶放置于铁托盘中，在开启真空冷冻干燥机前先排出仪器中残留水，并先抽真空，待温度降到-30℃以下，将样品放入真空冷冻干燥机，进行冷冻干燥；得到生物被膜态乳酸菌冻干粉发酵菌剂。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述乳酸菌微生物为LactobacillusplantarumE11。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘蕾，饶瑜，刘国荣，陶雨飞，李娅琳，厍晓，钱杨，
申请(专利权)人：西华大学，
类型：发明
国别省市：四川,51