采用肠内菌代谢制备还原型萝卜硫苷的方法及检测方法技术

本发明专利技术提供了采用肠内菌代谢制备还原型萝卜硫苷的方法及检测方法，制备厌氧培养液和肠道菌液，将厌氧培养液和肠道菌液混合孵育后得肠菌培养液，再将萝卜苷提取物加入到肠菌培养液中，在肠道菌群作用下得到含有代谢物的粗品溶液，用葡聚糖凝胶分离纯化代谢产物获得高纯度的还原型萝卜硫苷。本发明专利技术所得还原型萝卜硫苷纯度高、纯化效果好。

METHODS AND DETERMINATION METHODS FOR PREPARATION OF REDUCED RAPPOSIDE BY METABOLISM OF ENTEROMYCES

The invention provides a method and a detection method for preparing reduced radish glucosinolates by using intestinal bacteria metabolism, and produces anaerobic culture fluid and intestinal bacterial liquid. After incubating the anaerobic culture medium and the intestinal bacteria liquid, the enteric bacteria culture solution is obtained, and then the radish glycoside extract is added into the intestinal bacteria culture medium, and a crude solution containing metabolites is obtained under the action of the intestinal flora, and purified by Sephadex gel. High purity of reduced radish glycoside was obtained by metabolites. The reduced radish glycoside obtained by the invention has high purity and good purification effect.

【技术实现步骤摘要】
采用肠内菌代谢制备还原型萝卜硫苷的方法及检测方法
本专利技术涉及采用肠内菌代谢制备还原型萝卜硫苷的方法及检测方法，属于中药领域。
技术介绍
十字花科蔬菜中含有丰富的还原型萝卜硫苷和黑芥子酶，研究发现还原型萝卜硫苷可通过黑芥子酶水解后，通过非酶催化分子内重排反应转化生成还原型萝卜硫素。还原型萝卜硫素(4-甲基硫-3-丁烯基异硫氰酸脂)，具有诱导Ⅱ相解毒酶活性的一种异硫氰酸脂类化合物，不仅会提高人体对致癌物的清除能力，还可以抑制杀死癌细胞。还原型萝卜硫素是十字花科蔬菜中发现抗癌活性最强的植物化学组分，对乳腺癌、肺癌、前列腺癌以及多种癌症都具有很强的抑制功效。还原型萝卜硫苷(Glucoraphasatin)，即4-甲硫基-3-丁烯基硫代葡萄糖(4-Methylsulfanyl-3-butenylglucosinolate)。因R基团为CH3SCH＝CH(CH2)2，还原型萝卜硫苷属于脂肪族硫苷中的一种，其酶解产物为具有显著抗癌活性的还原型萝卜硫素(Rraphasatin)。还原型萝卜硫素分子结构中的异硫氰酸基团非常活泼，极易与含巯基或羟基的化合物反应，致使其失去抗癌活性。目前制备还原型萝卜硫苷的方式是采用醇提水沉法从十字花科植物中提取还原型萝卜硫苷，再经过除杂后得到纯化的还原型萝卜硫苷，这种制备方式的转化效率较低，反应后得到杂质多，需要多次过滤，过滤后得到的还原型萝卜硫苷含量和纯度较低。这种方法不仅提高了成本，而且增加了后续纯化的难度。
技术实现思路
本专利技术针对还原型萝卜硫苷转化效率低、纯化工艺复杂、纯度不高的缺点，提供了一种制备高纯度还原型萝卜硫苷的方法，该方法纯化工艺简便、纯度高、转化效率高、能耗低，无污染。本专利技术是采用以下技术方案来实现的：采用肠内菌代谢制备还原型萝卜苷的方法，包括以下步骤：(1)样品液的制备将萝卜苷提取物加蒸馏水超声溶解到质量浓度为1.5～3mg·mL-1后加入到肠菌培养液中，放置在厌氧培养箱中孵育7～9h后，取出，加甲醇终止反应，得样品液；(2)还原性萝卜硫苷的制备将步骤(1)中的样品液，离心，上清液减压浓缩至近干，并用适量甲醇转移，通过0.45μm微孔滤膜，得到含有代谢物的粗品溶液，将粗品溶液上SephadexLH-20葡聚糖凝胶柱，以甲醇洗脱，分段收集并进行HPLC检测含有代谢物的洗脱液，将含有代谢物的洗脱液合并，50℃以下减压浓缩至近干，用适量蒸馏水转移，冷冻干燥，得代谢物纯品，即还原型萝卜硫苷纯品。优选的是：所述肠菌培养液的制备过程为先制备厌氧培养液，备用；再取健康人或动物粪便，加入生理盐水混合，充分混匀得混悬液，将混悬液放入离心机中离心8～13min，离心后取上清液即为肠道菌液，备用；最后将所述的肠道菌液加入到无菌厌氧培养液中充分混合，并置于厌氧培养箱中培养24h之后得肠菌培养液。优选的是：所述步骤(1)萝卜苷提取物为炒莱菔子提取液，莱菔子硫苷有效部位或萝卜苷纯品。优选的是：所述炒莱菔子提取液制备过程为将炒莱菔子饮片粉碎成粗粉，加入20倍量，提取15～30min，提取3次，合并提取液，浓缩至0.5g·mL-1；所述莱菔子硫苷有效部位制备过程为将炒莱菔子饮片粉碎成粗粉，加入20倍量，提取15～30min，提取3次，合并提取液，浓缩至0.5g·mL-1，将浓缩后的炒莱菔子提取液，上AB-8大孔吸附树脂，上样量为0.5～0.75BV，上样流速0.5～1BV·h-1，以水洗脱，洗脱流速为1～2BV·h-1，洗脱体积为3～5BV，收集水洗脱液，浓缩，减压干燥即得；所述萝卜苷纯品制备过程为将炒莱菔子饮片粉碎成粗粉，加入20倍量，提取15～30min，提取3次，合并提取液，浓缩至0.5g·mL-1得炒莱菔子提取液，将炒莱菔子提取液减压浓缩至质量浓度为0.1～0.2g·mL-1，通过D301氯型阴离子交换树脂，上样量为7BV，上样液吸附流速为1～3BV·h-1，水洗脱用量3BV，以浓度为5％～10％NaCl溶液3～5BV洗脱，洗脱流速为1～2BV·h-1；将收集的洗脱液减压浓缩，过滤，除去大部分盐，将浓缩液加水通过纳滤进一步除盐，减压浓缩，冷冻干燥，得到萝卜苷纯品。代谢物纯品分子量及结构的检测方法，包括以下步骤：S1：取步骤(2)中制备的代谢物纯品适量，加蒸馏水溶解，过0.22μm微孔滤膜，进高效液相色谱-飞行时间质谱仪测定代谢物纯品的分子量；S2：取步骤(2)制备的代谢物纯品适量，加DMSO溶解，采用核磁共振波谱仪获得该化合物的氢谱1H-NMR和碳谱13C-NMR数据；综合质谱和核磁共振检测结果，确证产品为还原型萝卜硫苷，即4-甲硫基-3-丁烯基硫代葡萄糖。优选的是：所述代谢物纯品的分子量及结构的检测方法的色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；流动相A为0.1％甲酸乙腈，流动相B为0.1％甲酸水；梯度洗脱时间为：0～5min，2％A，5～8min，2％A～5％A；8～10min，5％A～12.5％A；10～12min，12.5％A～14％A；12～25min，14％A～25％A；25～32min，25％A～100％A；32～40min，100％A；柱温为25～30℃；流速为0.3mL·min-1；进样量3μL；波长为225nm；所述飞行时间质谱仪为配备标准电喷雾离子源的Agilent6230飞行时间质谱仪，离子源为电喷雾离子源；负离子检测模式，扫描范围为m/z50～1000；干燥气流量为10L·min-1；雾化器压力为30Pa；干燥器温度为350℃，毛细管电压为4KV。优选的是：所述色谱柱为柱长2.1mm×100mm，填料粒径2.7μm的Halo-C18柱。所述代谢物纯品纯度的检测方法包括以下步骤：取步骤(2)制备的代谢物纯品适量，加初始流动相溶解，过0.22μm微孔滤膜，进高效液相色谱仪，采用面积归一化法计算其纯度。优选的是：所述色谱条件为：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶柱，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸；梯度洗脱时间为：0～5min，2％A，5～8min，2％A～5％A；8～10min，5％A～12.5％A；10～12min，12.5％A～14％A；12～25min，14％A～25％A；25～40min，25％A～50％A；40～50min，50％A～70％A；50～60min，70％A～100％A；柱温为25～30℃；流速为1mL·min-1；波长为225nm。优选的是：所述色谱柱的规格为柱长4.6mm×250mm，填料粒径5μm的InertSuatainAQ-C18色谱柱。本专利技术的有益效果：在肠道菌液的作用下，大部分萝卜苷转化为还原型萝卜硫苷，转化效率高，产生杂质较少，减轻后续的纯化难度，萝卜苷降解率高；药物在生物体内不可避免的与肠道菌群接触，某些药物成分需经过肠菌的作用，发生代谢转化后才能被吸收。采用葡聚糖凝胶分离制备还原型萝卜硫苷纯品，得到的还原型萝卜硫苷纯度高于90％，纯品颜色为纯白色，吸湿性强。采用质谱、核磁共振对制备得到的还原型萝卜硫苷纯品进行结构鉴定，结果证明符合还原型萝卜硫苷的分子结构特征，确证最后得到的产品为还原型萝卜硫苷。该方法可为萝卜原料和其他十字花科蔬菜中还原型萝卜硫苷的提取、纯化和结构鉴定提供参考，也可为含还原型萝卜硫苷的保健品和功能本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.采用肠内菌代谢制备还原型萝卜硫苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)样品液的制备将萝卜苷提取物加蒸馏水超声溶解到质量浓度为1.5～3mg·mL‑1后加入到肠菌培养液中，放置在厌氧培养箱中孵育7～9h后，取出，加甲醇终止反应，得样品液；(2)还原性萝卜硫苷的制备将步骤(1)中的样品液，离心，上清液减压浓缩至近干，并用适量甲醇转移，通过0.45μm微孔滤膜，得到含有代谢物的粗品溶液，将粗品溶液上SephadexLH‑20葡聚糖凝胶柱，以甲醇洗脱，分段收集并进行HPLC检测含有代谢物的洗脱液，将含有代谢物的洗脱液合并，50℃以下减压浓缩至近干，用适量蒸馏水转移，冷冻干燥，得代谢物纯品，即还原型萝卜硫苷纯品。

【技术特征摘要】
1.采用肠内菌代谢制备还原型萝卜硫苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)样品液的制备将萝卜苷提取物加蒸馏水超声溶解到质量浓度为1.5～3mg·mL-1后加入到肠菌培养液中，放置在厌氧培养箱中孵育7～9h后，取出，加甲醇终止反应，得样品液；(2)还原性萝卜硫苷的制备将步骤(1)中的样品液，离心，上清液减压浓缩至近干，并用适量甲醇转移，通过0.45μm微孔滤膜，得到含有代谢物的粗品溶液，将粗品溶液上SephadexLH-20葡聚糖凝胶柱，以甲醇洗脱，分段收集并进行HPLC检测含有代谢物的洗脱液，将含有代谢物的洗脱液合并，50℃以下减压浓缩至近干，用适量蒸馏水转移，冷冻干燥，得代谢物纯品，即还原型萝卜硫苷纯品。2.根据权利要求1所述的采用肠内菌代谢制备还原型萝卜硫苷的方法，其特征在于：所述肠菌培养液的制备过程为先制备厌氧培养液，备用；再取健康人或动物粪便，加入生理盐水混合，充分混匀得混悬液，将混悬液放入离心机中离心8～13min，离心后取上清液即为肠道菌液，备用；最后将所述的肠道菌液加入到无菌厌氧培养液中充分混合，并置于厌氧培养箱中培养24h之后得肠菌培养液。3.根据权利要求1所述的采用肠内菌代谢制备还原型萝卜硫苷的方法，其特征在于：步骤(1)中萝卜苷提取物为炒莱菔子提取液，莱菔子硫苷有效部位或萝卜苷纯品。4.根据权利要求3所述的采用肠内菌代谢制备还原型萝卜硫苷的方法，其特征在于：所述炒莱菔子提取液制备过程为将炒莱菔子饮片粉碎成粗粉，加入20倍量，提取15～30min，提取3次，合并提取液，浓缩至0.5g·mL-1；所述莱菔子硫苷有效部位制备过程为将炒莱菔子饮片粉碎成粗粉，加入20倍量，提取15～30min，提取3次，合并提取液，浓缩至0.5g·mL-1，将浓缩后的炒莱菔子提取液，上AB-8大孔吸附树脂，上样量为0.5～0.75BV，上样流速0.5～1BV·h-1，以水洗脱，洗脱流速为1～2BV·h-1，洗脱体积为3～5BV，收集水洗脱液，浓缩，减压干燥即得；所述萝卜苷纯品制备过程为将炒莱菔子饮片粉碎成粗粉，加入20倍量，提取15～30min，提取3次，合并提取液，浓缩至0.5g·mL-1得炒莱菔子提取液，将炒莱菔子提取液减压浓缩至质量浓度为0.1～0.2g·mL-1，通过D301氯型阴离子交换树脂，上样量为7BV，上样液吸附流速为1～3BV·h-1，水洗脱用量3BV，以浓度为5％～10％NaCl溶液3～5BV洗脱，洗脱流速为1～2BV·h-1，将收集的洗脱液减压浓缩，过滤，除去大部分盐，将浓缩液加水通过纳滤进一步除盐，减压浓缩，冷冻干燥，得到萝卜苷纯品。5.一种如权利要求1所述的采用肠内菌代谢制备还原型萝卜硫苷的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述代谢物纯品分子量及结构的检测方法，包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱立俏，盛华刚，张茜，周洪雷，
申请(专利权)人：山东中医药大学，
类型：发明
国别省市：山东,37