The invention provides a CHv BAC G gE CT without trace deletion in CT region of duck plague virus gE gene and a construction method thereof. The present invention utilizes GS1783 E. coli and pEPkan S plasmid to construct the CT region of duck plague virus gE gene without exogenous base residue on the platform of the bacterial artificial chromosome recombinant duck plague virus rescue system by homologous recombination. The technical scheme of the invention solves the problem of residual base at the deleted site when the duck plague virus gene is deleted, and provides sufficient technical support for accurately exploring the gene function of the duck plague virus and constructing the live attenuated vaccine.
【技术实现步骤摘要】
鸭瘟病毒gE基因CT区域无痕缺失株CHv-BAC-G-gEΔCT及其构建方法
本专利技术属于基因工程
,具体涉及一种鸭瘟病毒gE基因CT区域无痕缺失株CHv-BAC-G-gEΔCT及其构建方法。
技术介绍
细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)是一种新发展起来的DNA载体系统,它具有容量大、遗传特性稳定、易于操作等优点,在基因文库构建和基因功能分析等方面有广泛的应用。将完整病毒基因组DNA分子插入BAC载体,利用该载体编码的最小生育力因子复制子(Minimalfertilityfactorreplicon,Mini-F)获得分子克隆化病毒,并结合大肠杆菌中成熟的基因定位修饰技术,从而实现在原核系统中病毒基因的缺失及外源基因的插入。目前较为常用的大肠杆菌基因定位修饰技术主要包括Red/ET介导的同源重组技术、RecA蛋白介导的同源重组技术、Cre/loxP介导的同源重组技术以及Tn转座子介导的随机插入和突变技术。利用分子克隆化技术手段现已获得成熟的细菌人工染色体鸭瘟病毒拯救系统平台,同时利用大肠杆菌基因定位修饰Red/ET介导的同源重组技术可在细菌人工染色体鸭瘟病毒拯救系统平台上进行鸭瘟病毒基因的缺失和外源基因的插入,该成果极大的推动了鸭瘟病毒基因功能的研究进程。Red/ET介导的同源重组技术是基于λ-噬菌体Red操纵子(Redα/Redβ/Redγ)和Rac噬菌体RecE/RecT同源重组酶的同源重组打靶技术。该技术操作简单、快速、高效,广泛应用于基因缺失、突变工作。但是利用该操作技术进行基因缺失、突变会 ...
【技术保护点】
1.鸭瘟病毒gE基因CT区域无痕缺失株CHv‑BAC‑G‑gEΔCT的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)将pBAC‑DPV质粒转化到GS1783大肠杆菌感受态中,获得GS1783‑pBAC‑DPV菌株,然后制备GS1783‑pBAC‑DPV感受态;(2)以pEPkan‑S为模板,以GS1783‑BAC‑gEΔCT‑F和GS1783‑BAC‑gEΔCT‑R作为引物,通过PCR方法扩增包含I_SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段以及gE基因CT区域上游和下游各40bp同源臂的打靶片段I_SceI‑Kana‑CT,切胶回收获得I_SceI‑Kana‑CT片段;(3)将I_SceI‑Kana‑CT片段转化到GS1783‑pBAC‑DPV感受态中,筛选,获得阳性克隆子GS1783‑pBAC‑DPV‑CT‑Kana;(4)将阳性克隆子GS1783‑pBAC‑DPV‑CT‑Kana中的I_SceI‑Kana片段去掉,经抗生素筛选和PCR鉴定,获得阳性克隆子GS1783‑pBAC‑DPV‑gEΔCT;(5)从阳性克隆子GS1783‑pBAC‑DPV‑gEΔCT中提取pBAC‑DPV‑gEΔ ...
【技术特征摘要】
1.鸭瘟病毒gE基因CT区域无痕缺失株CHv-BAC-G-gEΔCT的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)将pBAC-DPV质粒转化到GS1783大肠杆菌感受态中,获得GS1783-pBAC-DPV菌株,然后制备GS1783-pBAC-DPV感受态;(2)以pEPkan-S为模板,以GS1783-BAC-gEΔCT-F和GS1783-BAC-gEΔCT-R作为引物,通过PCR方法扩增包含I_SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段以及gE基因CT区域上游和下游各40bp同源臂的打靶片段I_SceI-Kana-CT,切胶回收获得I_SceI-Kana-CT片段;(3)将I_SceI-Kana-CT片段转化到GS1783-pBAC-DPV感受态中,筛选,获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-CT-Kana;(4)将阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-CT-Kana中的I_SceI-Kana片段去掉,经抗生素筛选和PCR鉴定,获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-gEΔCT;(5)从阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-gEΔCT中提取pBAC-DPV-gEΔCT质粒,将pBAC-DPV-gEΔCT质粒转染DEF细胞,通过克隆筛选,获得gE基因CT区域无痕缺失株CHv-BAC-G-gEΔCT。2.根据权利要求1所述...
【专利技术属性】
技术研发人员:汪铭书,刘田,秦旭东,程安春,黄雅琳,
申请(专利权)人:四川农业大学,
类型:发明
国别省市:四川,51
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