用于使用多个引导RNA来破坏免疫耐受性的方法技术

提供用于制备对目标外来抗原的耐受性降低的非人动物以及使用所述动物来制备针对所述目标外来抗原的抗原结合蛋白的方法和组合物。所述方法和组合物采用使用多个引导RNA的CRISPR/Cas9系统来使与目标外来抗原同源或共有目标表位的自身抗原的表达降低或消除，或使所述自身抗原上的与目标外来抗原共有的表位的表达降低或消除。

A method for destroying immune tolerance by using multiple guided RNA

A method and composition for preparing non-human animals with reduced tolerance to target foreign antigens and for preparing antigen-binding proteins against the target foreign antigens using the animals are provided. The methods and compositions employ a CRISP R/Cas9 system using multiple guided RNA to reduce or eliminate the expression of self-antigens homologous to or sharing target epitopes with target foreign antigens, or to reduce or eliminate the expression of epitopes common to target foreign antigens on said self-antigens.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于使用多个引导RNA来破坏免疫耐受性的方法通过EFS网以文本文件形式提交的序列表的引用写入文件497023SEQLIST.txt中的序列表是38.3千字节，于2017年5月18日创建，并且据此以引用的方式并入。
技术介绍
用“非自身”蛋白质使非人动物(例如啮齿动物，诸如小鼠或大鼠)免疫是一种通常使用的用以获得特异性抗原结合蛋白诸如单克隆抗体的方法。然而，这个方法依赖于非人动物中的天然蛋白质与经免疫以使得非人动物的免疫系统能够将免疫原识别为非自身(即外来)的蛋白质之间的序列趋异性。产生针对与自身抗原具有高度同源性的抗原的抗体可由于免疫耐受性而是一项困难任务。因为蛋白质的在功能上重要的区域在物种之间倾向于保守，所以对自身抗原的免疫耐受性常常对产生针对这些关键表位的抗体造成挑战。尽管已在靶向各种基因组基因座方面取得进展，但仍然有许多不能以常规靶向策略高效靶向的基因组基因座或不能以常规靶向策略高效实现的基因组修饰。CRISPR/Cas系统已提供一种用于基因组编辑的新工具，但仍然存在困难。举例来说，当试图特别是在真核细胞和生物体中产生大型靶向基因组缺失或其他大型靶向遗传修饰时，困难可仍然在一些情形下出现。此外，可难以在无后续交配步骤下高效产生就靶向遗传修饰来说是纯合的细胞或动物，并且一些基因座相比于其他基因座可更加难以进行靶向以产生纯合性靶向修饰。举例来说，尽管就某一大型靶向基因组缺失来说是杂合的F0代小鼠可有时通过常规靶向策略来获得，但产生就所述缺失来说是纯合的F1代小鼠需要这些杂合性小鼠的后续交配。这些额外交配步骤是昂贵的和耗时的。
技术实现思路
提供用于制备对目标外来抗原的耐受性降低的非人动物以及使用所述动物来产生结合所述目标外来抗原的抗原结合蛋白的方法和组合物。在一个方面，本专利技术提供一种制备对目标外来抗原的耐受性降低的非人动物的方法，其包括：(a)使不是单细胞期胚胎的非人动物多能细胞的基因组与以下各物接触：(i)Cas9蛋白；(ii)杂交至第一靶基因组基因座内的第一引导RNA识别序列的第一引导RNA，其中所述第一靶基因组基因座影响与所述目标外来抗原同源或共有目标表位的第一自身抗原的表达；和(iii)杂交至所述第一靶基因组基因座内的第二引导RNA识别序列的第二引导RNA；其中一对第一染色体和第二染色体中的所述第一靶基因组基因座被修饰以产生具有双等位基因修饰的经修饰非人动物多能细胞，其中所述第一自身抗原的表达降低；(b)将所述经修饰非人动物多能细胞引入宿主胚胎中；和(c)将所述宿主胚胎植入代孕母体中以产生经遗传修饰的F0代非人动物，其中所述一对第一染色体和第二染色体中的所述第一靶基因组基因座被修饰以使所述第一自身抗原的表达降低。任选地，多能细胞是胚胎干(ES)细胞。任选地，接触包括通过核转染来将Cas9蛋白、第一引导RNA和第二引导RNA引入非人动物多能细胞中。任选地，将Cas9蛋白以编码Cas9蛋白的DNA形式引入非人动物多能细胞中，将第一引导RNA以编码第一引导RNA的DNA形式引入非人动物多能细胞中，并且将第二引导RNA以编码第二引导RNA的DNA形式引入非人动物多能细胞中。在一些所述方法中，接触步骤(a)进一步包括使基因组与：(iv)杂交至第一靶基因组基因座内的第三引导RNA识别序列的第三引导RNA；和/或(v)杂交至第一靶基因组基因座内的第四引导RNA识别序列的第四引导RNA接触。在一些所述方法中，接触步骤(a)进一步包括使基因组与以下各物接触：(iv)杂交至第二靶基因组基因座内的第三引导RNA识别序列的第三引导RNA，其中所述第二靶基因组基因座影响第一自身抗原或与目标外来抗原同源或共有目标表位的第二自身抗原的表达；和/或(v)杂交至所述第二靶基因组基因座内的第四引导RNA识别序列的第四引导RNA。在一些所述方法中，接触步骤(a)进一步包括使基因组与包含会在靶基因组基因座处杂交于5’靶标序列的5’同源臂和会在靶基因组基因座处杂交于3’靶标序列的3’同源臂的外源性修复模板接触。任选地，外源性修复模板进一步包含由5’同源臂和3’同源臂侧接的核酸插入物。在一些所述方法中，核酸插入物与第一靶基因组基因座同源或直系同源。在一些所述方法中，外源性修复模板的长度在约50个核苷酸至约1kb之间。在一些所述方法中，外源性修复模板的长度在约80个核苷酸至约200个核苷酸之间。在一些所述方法中，外源性修复模板是单链寡脱氧核苷酸。在一些所述方法中，外源性修复模板是长度是至少10kb的大型靶向载体(LTVEC)，和/或外源性修复模板是LTVEC，其中LTVEC的5’同源臂和3’同源臂的总和的长度是至少10kb。一些所述方法进一步包括：(d)用目标外来抗原使在步骤(c)中产生的经遗传修饰的F0代非人动物免疫；(e)在足以引发对目标外来抗原的免疫应答的条件下维持经遗传修饰的F0代非人动物；和(f)从经遗传修饰的F0代非人动物获得编码人免疫球蛋白重链可变结构域的第一核酸序列和/或编码人免疫球蛋白轻链可变结构域的第二核酸序列。在一些所述方法中，相比于在使在第一靶基因组基因座处是野生型的对照非人动物免疫之后获得的抗原结合蛋白，在用目标外来抗原使经遗传修饰的F0代非人动物免疫之后获得的针对目标外来抗原的抗原结合蛋白具有更高效价。在一些所述方法中，相较于在使在第一靶基因组基因座处是野生型的对照非人动物免疫之后获得的抗原结合蛋白，在用目标外来抗原使经遗传修饰的F0代非人动物免疫之后获得更具多样性的针对目标外来抗原的抗原结合蛋白谱系。在一些所述方法中，第一自身抗原的表达被消除。在一些所述方法中，目标外来抗原是第一自身抗原的直系同源物。在一些所述方法中，目标外来抗原包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：人蛋白质的全部或一部分。在一些所述方法中，第一靶基因组基因座被修饰以包含一个或多个核苷酸的插入、一个或多个核苷酸的缺失或一个或多个核苷酸的替换。在一些所述方法中，第一靶基因组基因座被修饰以包含一个或多个核苷酸的缺失。在一些所述方法中，接触步骤(a)包括使基因组与包含会在靶基因组基因座处杂交于5’靶标序列的5’同源臂和会在靶基因组基因座处杂交于3’靶标序列的3’同源臂的外源性修复模板接触，前提是如果基因组在单细胞期胚胎中，那么所述外源性修复模板的长度是不超过5kb，其中所述外源性修复模板包含由所述5’同源臂和所述3’同源臂侧接的核酸插入物，其中所述核酸插入物与经缺失核酸序列同源或直系同源，并且其中所述核酸插入物替换经缺失核酸序列。在一些所述方法中，缺失是无随机插入和缺失(插入缺失)的精确缺失。在一些所述方法中，接触步骤(a)包括使基因组与包含会在靶基因组基因座处杂交于5’靶标序列的5’同源臂和会在靶基因组基因座处杂交于3’靶标序列的3’同源臂的外源性修复模板接触，前提是如果基因组在单细胞期胚胎中，那么所述外源性修复模板的长度是不超过5kb，其中经缺失核酸序列由在5’靶标序列与3’靶标序列之间的核酸序列组成。在一些所述方法中，第一靶基因组基因座包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：编码第一自身抗原的基因的全部或一部分。在一些所述方法中，修饰包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：编码第一自身抗原的基因的全部或一部分的纯合性缺失。在一些所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产生针对目标外来抗原的抗原结合蛋白的方法，其包括：(a)制备对目标外来抗原的耐受性降低的经遗传修饰的非人动物，其包括：(i)向非人动物单细胞期胚胎或不是单细胞期胚胎的非人动物多能细胞中引入：(I)Cas9蛋白；(II)杂交至靶基因组基因座内的第一引导RNA识别序列的第一引导RNA，其中所述靶基因组基因座包含编码与所述目标外来抗原同源或共有目标表位的自身抗原的基因的全部或一部分；和(III)杂交至所述靶基因组基因座内的第二引导RNA识别序列的第二引导RNA；其中在一对相应第一染色体和第二染色体中所述靶基因组基因座被修饰以产生具有双等位基因修饰的经修饰非人动物单细胞期胚胎或经修饰非人动物多能细胞，其中所述自身抗原的表达被消除；和(ii)从所述经修饰非人动物单细胞期胚胎或所述经修饰非人动物多能细胞产生经遗传修饰的F0代非人动物，其中在所述经遗传修饰的F0代非人动物中的所述一对相应第一染色体和第二染色体中所述靶基因组基因座被修饰以使所述自身抗原的表达被消除；(b)用所述目标外来抗原使在步骤(a)中产生的所述经遗传修饰的F0代非人动物免疫；和(c)在足以引发对所述目标外来抗原的免疫应答的条件下维持所述经遗传修饰的F0代非人动物，其中所述经遗传修饰的F0代非人动物产生针对所述目标外来抗原的抗原结合蛋白。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.05.20 US 62/339,472;2016.07.29 US 62/368,6041.一种产生针对目标外来抗原的抗原结合蛋白的方法，其包括：(a)制备对目标外来抗原的耐受性降低的经遗传修饰的非人动物，其包括：(i)向非人动物单细胞期胚胎或不是单细胞期胚胎的非人动物多能细胞中引入：(I)Cas9蛋白；(II)杂交至靶基因组基因座内的第一引导RNA识别序列的第一引导RNA，其中所述靶基因组基因座包含编码与所述目标外来抗原同源或共有目标表位的自身抗原的基因的全部或一部分；和(III)杂交至所述靶基因组基因座内的第二引导RNA识别序列的第二引导RNA；其中在一对相应第一染色体和第二染色体中所述靶基因组基因座被修饰以产生具有双等位基因修饰的经修饰非人动物单细胞期胚胎或经修饰非人动物多能细胞，其中所述自身抗原的表达被消除；和(ii)从所述经修饰非人动物单细胞期胚胎或所述经修饰非人动物多能细胞产生经遗传修饰的F0代非人动物，其中在所述经遗传修饰的F0代非人动物中的所述一对相应第一染色体和第二染色体中所述靶基因组基因座被修饰以使所述自身抗原的表达被消除；(b)用所述目标外来抗原使在步骤(a)中产生的所述经遗传修饰的F0代非人动物免疫；和(c)在足以引发对所述目标外来抗原的免疫应答的条件下维持所述经遗传修饰的F0代非人动物，其中所述经遗传修饰的F0代非人动物产生针对所述目标外来抗原的抗原结合蛋白。2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)(i)中的所述细胞是所述非人动物多能干细胞，并且在步骤(a)(ii)中产生所述经遗传修饰的F0代非人动物包括：(I)将所述经修饰非人动物多能细胞引入宿主胚胎中；和(II)将所述宿主胚胎植入代孕母体中以产生所述经遗传修饰的F0代非人动物，其中所述一对相应第一染色体和第二染色体中的所述靶基因组基因座被修饰以使所述自身抗原的表达被消除。3.如权利要求2所述的方法，其中所述多能细胞是胚胎干(ES)细胞。4.如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)(i)中的所述细胞是所述非人动物单细胞期胚胎，并且在步骤(a)(ii)中产生所述经遗传修饰的F0代非人动物包括将所述经修饰非人动物单细胞期胚胎植入代孕母体中以产生所述经遗传修饰的F0代非人动物，其中所述一对相应第一染色体和第二染色体中的所述靶基因组基因座被修饰以使所述自身抗原的表达被消除。5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其进一步包括从分离自经免疫的经遗传修饰F0代非人动物的B细胞制备杂交瘤。6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其进一步包括从所述经免疫的经遗传修饰F0代非人动物获得编码针对所述目标外来抗原的所述抗原结合蛋白的免疫球蛋白重链可变结构域的第一核酸序列和/或编码针对所述目标外来抗原的所述抗原结合蛋白的免疫球蛋白轻链可变结构域的第二核酸序列。7.如权利要求6所述的方法，其中所述第一核酸序列和/或所述第二核酸序列从所述经遗传修饰的F0代非人动物的淋巴细胞或从由所述淋巴细胞产生的杂交瘤获得。8.如权利要求6或7所述的方法，其中所述经遗传修饰的F0代非人动物包含人源化免疫球蛋白基因座，并且其中所述第一核酸序列编码人免疫球蛋白重链可变结构域，并且所述第二核酸序列编码人免疫球蛋白轻链可变结构域。9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中相比于在用所述目标外来抗原使对照非人动物免疫之后由在所述靶基因组基因座处是野生型的所述对照非人动物产生的抗原结合蛋白，由所述经遗传修饰的F0代非人动物产生的针对所述目标外来抗原的所述抗原结合蛋白具有更高效价。10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中相较于在用所述目标外来抗原使对照非人动物免疫之后由在所述靶基因组基因座处是野生型的所述对照非人动物产生的抗原结合蛋白，在用所述目标外来抗原使所述经遗传修饰的F0代非人动物免疫之后由所述经遗传修饰的F0代非人动物产生更具多样性的针对所述目标外来抗原的抗原结合蛋白谱系。11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中相较于在用所述目标外来抗原使对照非人动物免疫之后由在所述靶基因组基因座处是野生型的所述对照非人动物产生的抗原结合蛋白，由所述经遗传修饰的F0代非人动物产生的针对所述目标外来抗原的所述抗原结合蛋白使用更大多样性的重链V基因区段和/或轻链V基因区段。12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中由所述经遗传修饰的F0代非人动物产生的一些针对所述目标外来抗原的所述抗原结合蛋白与所述自身抗原交叉反应。13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中在所述靶基因组基因座中，所述第一引导RNA识别序列在所述第二引导RNA识别序列的5’，并且其中步骤(a)(i)进一步包括进行保留测定以确定在所述第一引导RNA识别序列的5’以及约1kb内的区域和/或在所述第二引导RNA识别序列的3’以及约1kb内的区域的拷贝数是2。14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述目标外来抗原是所述自身抗原的直系同源物。15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述目标外来抗原包含人蛋白质的全部或一部分。16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述靶基因组基因座被修饰以包含一个或多个核苷酸的插入、一个或多个核苷酸的缺失或一个或多个核苷酸的替换。17.如权利要求16所述的方法，其中所述靶基因组基因座被修饰以包含一个或多个核苷酸的缺失。18.如权利要求17所述的方法，其中所述缺失是无随机插入和缺失(插入缺失)的精确缺失。19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述第一引导RNA识别序列包含编码所述自身抗原的所述基因的起始密码子，或在所述起始密码子的约10、20、30、40、50、100、200、300、400、500或1,000个核苷酸内，并且所述第二引导RNA识别序列包含编码所述自身抗原的所述基因的终止密码子，或在所述终止密码子的约10、20、30、40、50、100、200、300、400、500或1,000个核苷酸内。20.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述第一引导RNA识别序列和所述第二引导RNA识别序列不同，并且所述第一引导RNA识别序列和所述第二引导RNA识别序列中的每一个包含编码所述自身抗原的所述基因的起始密码子，或在所述起始密码子的约10、20、30、40、50、100、200、300、400、500或1,000个核苷酸内。21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述靶基因组基因座被修饰以包含在约0.1kb至约200kb之间的双等位基因缺失。22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述修饰包括编码所述自身抗原的所述基因的全部或一部分的双等位基因缺失。23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述修饰包括编码所述自身抗原的所述基因的起始密码子的双等位基因破坏。24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中引入步骤(a)(i)进一步包括向所述非人动物多能细胞或所述非人动物单细胞期胚胎中引入：(iv)杂交至所述靶基因组基因座内的第三引导RNA识别序列的第三引导RNA；和/或(v)杂交至所述靶基因组基因座内的第四引导RNA识别序列的第四引导RNA。25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中步骤(a)(i)中的所述细胞是所述非人动物多能干细胞，并且将所述Cas9蛋白、所述第一引导RNA和所述第二引导RNA各自以DNA形式引入所述非人动物多能干细胞中。26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中步骤(a)(i)中的所述细胞是所述非人动物多能干细胞，并且将所述Cas9蛋白、所述第一引导RNA和所述第二引导RNA各自通过电穿孔或核转染来引入所述非人动物多能干细胞中。27.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中步骤(a)(i)中的所述细胞是所述非人动物单细胞期胚胎，并且将所述Cas9蛋白、所述第一引导RNA和所述第二引导RNA各自以RNA形式引入所述非人动物单细胞期胚胎中。28.如权利要求1-24和27中任一项所述的方法，其中步骤(a)(i)中的所述细胞是所述非人动物单细胞期胚胎，并且将所述Cas9蛋白、所述第一引导RNA和所述第二引导RNA通过原核注射或细胞质注射来引入所述非人动物单细胞期胚胎中。29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中不在步骤(a)(i)中引入外源性修复模板。30.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述引入步骤(a)(i)进一步包括向所述非人动物多能细胞或所述非人动物单细胞期胚胎中引入外源性修复模板，所述外源性修复模板包含在所述靶基因组基因座处杂交至5’靶标序列的5’同源臂和在所述靶基因组基因座处杂交至3’靶标序列的3’同源臂，前提是如果步骤(a)(i)中的所述细胞是所述非人动物单细胞期胚胎，那么所述外源性修复模板的长度是不超过约5kb。31.如权利要求30所述的方法，其中所述外源性修复模板进一步包含由所述5’同源臂和所述3’同源臂侧接的核酸插入物。32.如权利要求31所述的方法，其中所述核酸插入物与所述靶基因组基因座同源或直系同源。33.如权利要求30-32中任一项所述的方法，其中所述外源性修复模板的长度在约50个核苷酸至约1kb之间。34.如权利要求33所述的方法，其中所述外源性修复模板的长度在约80个核苷酸至约200个核苷酸之间。35.如权利要求30-34中任一项所述的方法，其中所述外源性修复模板是单链寡脱氧核苷酸。36.如权利要求30-32中任一项所述的方法，其中步骤(a)(i)中的所述细胞是所述非人动物多能细胞，并且其中：(a)所述外源性修复模板是长度是至少10kb的大型靶向载体(LTVEC)；或(b)所述外源性修复模板是LTVEC，其中所述LTVEC的5’同源臂和3’同源臂的总和的长度是至少10kb。37.如权利要求30-36中任一项所述的方法，其中所述靶基因组基因座被修饰以包含一个或多个核苷酸的缺失，并且其中经缺失核酸序列由在所述5’靶标序列与所述3’靶标序列之间的核酸序列组成。38.如权利要求30-37中任一项所述的方法，其中所述外源性修复模板包含由所述5’同源臂和所述3’同源臂侧接的核酸插入物，其中所述核酸插入物与所述经缺失核酸序列同源或直系同源，其中所述靶基因组基因座被修饰以包含一个或多个核苷酸的缺失，并且其中所述核酸插入物替换所述经缺失核酸序列。39.如权利要求1-38中任一项所述的方法，其中所述非人动物包含人源化免疫球蛋白基因座。40.如权利要求1-39中任一项所述的方法，其中所述非人动物是啮齿动物。41.如权利要求40所述的方法，其中所述啮齿动物是小鼠。42.如权利要求41所述的方法，其中小鼠品系包括BALB/c品系。43.如权利要求42所述的方法，其中所述小鼠品系包括BALB/c、C57BL/6和129品系。44.如权利要求43所述的方法，其中所述小鼠品系是50％BALB/c、25％C57BL/6和25％129。45.如权利要求41-44中任一项所述的方法，其中所述小鼠的MHC单倍型是MHCb/d。46.如权利要求41-45中任一项所述的方法，其中所述小鼠在它的种系中包含插入在内源性小鼠免疫球蛋白基因座处的人未重排可变区基因区段。47.如权利要求46所述的方法，其中所述人未重排可变区基因区段是重链基因区段，并且所述小鼠免疫球蛋白基因座是重链基因座，和/或其中所述人未重排可变区基因区段是κ或λ轻链区段，并且所述小鼠免疫球蛋白基因座是轻链基因座。48.如权利要求46或47所述的方法，其中所述小鼠在它的种系中包含可操作地连接至小鼠恒定区基因的人未重排可变区基因区段，其中所述小鼠缺乏人恒定区基因，并且其中所述小鼠恒定区基因在内源性小鼠免疫球蛋白基因座处。49.如权利要求46-48中任一项所述的方法，其中所述小鼠包含：(a)杂合重链基因座，其包含人免疫球蛋白重链V、D和J基因区段的插入，其中所述人重链免疫球蛋白V、D和J基因区段可操作地连接至小鼠免疫球蛋白重链基因，其中所述小鼠免疫球蛋白重链基因在内源性小鼠免疫球蛋白基因座处；和(b)杂合轻链基因座，其包含人免疫球蛋白轻链V和J基因区段的插入，其中所述人V和J基因区段可操作地连接至小鼠免疫球蛋白轻链恒定区基因序列；其中(a)重排以形成包含可操作地连接至小鼠恒定区的人...

【专利技术属性】
技术研发人员：维拉·沃罗宁那，林恩·麦克唐纳，马林·普里塞特，卡曼·维纳斯·莱，阿肖克·巴迪斯，安德鲁·J·莫菲，古斯塔沃·德罗格特，大卫·佛伦杜威，布莱恩·扎姆布罗维兹，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国,US