狗源化PD-1基因改造动物模型的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种能够特异的靶向Pd‑1基因的sgRNA、一种PD‑1基因狗源化动物模型。本发明专利技术还公开了一种制备狗源化动物模型的sgRNA载体的方法、一种狗源化动物模型的制备方法以及相关应用，并制备出世界上首例基因修饰狗源化小鼠，该小鼠能正常表达含有狗PD‑1蛋白功能域的PD‑1蛋白，可以作为靶向狗PD‑1、PD‑L1等信号机理研究，抑制剂筛选，毒理研究的动物模型，这对于研究狗PD‑1、PD‑L1基因的功能，以及在生物医药领域具有重要的应用价值。

Preparation and Application of Dog-derived PD-1 Genetically Modified Animal Model

The invention discloses a sgRNA that can specifically target Pd_ 1 gene and a dog-derived animal model of PD_ 1 gene. The invention also discloses a method for preparing sgRNA vector of dog-derived animal model, a method for preparing dog-derived animal model and its related application. The first genetically modified dog-derived mouse in the world is prepared. The mouse can normally express PD_1 protein containing dog PD_1 protein functional domain, and can be used as a signal mechanism research for targeting dog PD_1, PD_L1, etc. and screening inhibitors. The animal model of toxicological research has important application value in studying the function of dog PD_1 and PD_L1 genes and in the field of biomedicine.

【技术实现步骤摘要】
狗源化PD-1基因改造动物模型的制备方法及应用
本申请涉及狗源化基因改造动物模型的建立方法及应用，具体而言，涉及基于一种狗源化PD-1基因改造动物模型的构建方法及其在生物医药的应用。
技术介绍
犬类是最早被人类驯化的动物，是人类重要的伴侣动物。已有研究表明伴侣动物尤其是宠物犬能提供情感支持，让人的身心更加健康、生活满意度更高。在实践中豢养宠物犬作为一种替代疗法，可使抑郁患者、有社会退缩行为的患者有所康复。还有研究表明宠物犬对控制和降低国民健康医疗费用有所帮助(傅纳等，中国心理卫生杂志，2003，17(8)：569-571；郭君钰等，临床心身疾病杂志，2015(5)：74-77；王嘉顺等，医学与社会，2011，24(3)：85-87)。现代生活中有许多人饲养宠物犬，并视其为家庭的一员。根据统计数据，目前美国有7750万宠物狗，其中63.2％的家庭将宠物视为“家庭成员”，每年平均花费225美元用于宠物狗保健，仅次于人类接受医疗保健水平(U.S.PetOwnership&DemographicsSourcebook，2012；http://nationalveterinarycancerregistry.org/about-nvcr/pets-models)。在我国，2016年宠物狗的数量达到4990万只，年均医疗支出约为908元(数据来源：2017年中国宠物行业白皮书)。可见随着人们养宠观念的根本性转变，宠物健康问题越来越受到重视。癌症是导致犬类死亡的主要原因，50％的高龄犬(10岁以上)会发展自发性肿瘤，约有1/4的宠物犬死于癌症。目前犬类癌症的治疗以手术治疗、化学治疗和放射治疗为主，专门用于治疗动物尤其是犬类癌症的药物非常少，多数情况下兽医只能用最初为人类开发的药物治疗犬类癌症(DanielaO.H.Suzuki，etc，ArtifOrgans.2015Feb；39(2):192-7；MainaE，etc，VetDermatol.2014Dec；25(6):559-62，BrianW.DavisandElaineA.Ostrander，ILARJ.2014；55(1):59–68)。虽然大多数犬类可能对治疗有一定效果，但具有较大个体差异，且化疗和放疗持续时间通常较短。而且有些类型的癌症，如口腔黑色素瘤(oralmalignantmelanoma，OMM)是狗中常见的口腔恶性肿瘤，可能在任何口腔粘膜部位产生。由于具有高度侵袭和高转移倾向，OMM被认为是极度恶性的癌症，通常化疗无效，选择手术或放射治疗后生存率也不高(BergmanPJ，ClinTechSmallAnimPract.2007May；22(2):55-60；BrockleyLK,etc,NZVetJ.2013Jan；61(1):25-31)。因此有必要开发新的治疗方法来改善犬类癌症治疗的舒适度和生存率。肿瘤免疫疗法是当前肿瘤治疗领域中最具前景的研究方向之一，免疫疗法通过激活免疫系统攻击并杀死癌细胞，是近年来肿瘤研究的一个重要领域。目前和肿瘤免疫治疗相关的一些人用药物已经用于治疗，已有药品上市并应用在多个适应症，其中，以免疫检查点CTLA-4、PD-1及其配体PD-L1为靶点的免疫调节剂已经取得确切疗效。例如，在许多人类癌症中均可检测到异常的PD-L1蛋白表达，并被认为是癌症的免疫逃逸主要机制之一。已有研究表明犬类某些恶性肿瘤，如，狗黑色素瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、肥大细胞肿瘤、乳腺癌和前列腺癌均表达PD-L1，显示临床应用PD-1/PD-L1抑制剂作为对犬类癌症的新型治疗剂的治疗前景(MaekawaN等，PLoSOne.2016Jun8；11(6):e0157176，PD-L1；NaoyaMaekawaect，PLoSOne.2014；9(6):e98415)。然而，狗PD-1蛋白和鼠PD-1蛋白同源性56％，狗PD-1蛋白和人PD-1蛋白同源性65％。所以，一般情况下识别人PD-1蛋白的抗体，无法识别犬PD-1蛋白，即在犬类癌症治疗中，使用人PD-1药物治疗，可能会由于抗体靶向性和特异性不强，没有治疗效果或效果差。此外，免疫疗法有较明显的免疫毒性，在小鼠和人体中都有验证，如皮炎、大肠炎、垂体炎等，这种副作用与免疫应答程度直接相关，很难通过剂量调整避免，严格的药物筛选程序非常必要。狗作为重要的实验动物，一直以来广泛的用于实验外科(如心血管外科、组织移植等)、药理学(毒理学研究和药物代谢研究)、慢性实验研究(如条件反射实验、内分泌腺摘除试验等)以及医学研究(如失血性休克、脊髓传导实验、脂质在动脉壁中的沉积等)。此外，利用犬类自发性肿瘤的特点，以及多种犬类癌症与人类癌症有相似的症状和临床表现，加上宠物狗预期寿命较长，又暴露在与人类相似的环境中(毒素和致癌物质)，宠物犬正逐渐被认为是研究人类疾病及治疗的有价值的工具(KnappDWetc，ILARJ.2014；55(1):100-18.doi:10.1093/ilar/ilu018；VailDMect，ClinCancerRes.2009May15；15(10):3503-10)。理论上也可以直接使用狗作为实验动物，进行犬用抗肿瘤药物的筛选和研究，但存在明显缺陷及实际困难，如国际上公认的比较理想的近交系比格犬(beagles)，该犬类对气候要求高，繁育较难、成活率低、价格高，在国内科研中应用受到很大限制。小鼠作为更常用的实验动物，具有高繁殖、易饲养，繁殖周期短等特点，更容易开展大规模筛选试验，在药物筛选和药效初步验证等临床前研究方面具有明显优势。
技术实现思路
为了解决上述问题，本申请专利技术人提出可以将狗的基因放置在非人哺乳动物(除狗类外)，如，小鼠体内，制备得到的小鼠体内可表达狗蛋白或狗源化蛋白。特别是，由于抗体一般结合在抗原的胞外区，可以将小鼠体内编码抗原胞外区的基因序列全部或部分用狗的对应序列进行替换，这样得到的小鼠体内表达狗抗原蛋白或狗源化抗原蛋白，表达的抗原蛋白能被识别并结合抗狗抗体，且小鼠体内不表达内源性蛋白。该方法及制备的非人动物在狗用药物筛选、有效性验证等方面有着广阔的应用前景。此外，本方法得到的非人动物还可与其它狗源化非人动物交配，或进行进一步的基因编辑，得到双或多基因狗源化动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的更多的狗用药及药效研究。鉴于PD-1基因在肿瘤和免疫治疗领域具有巨大应用价值。为了使狗用药物药效试验更有效并提高研发成功率，本专利技术将以PD-1为例，在世界范围内首次提供一种建立PD-1基因狗源化改造动物模型的新方法，并得到PD-1基因狗源化动物，该动物体内可正常表达PD-1蛋白，且表达的PD-1蛋白能被识别并结合抗狗PD-1抗体。可以改造的其它基因包括但不限于：PD-L1，TIGIT、OX40、TIM-3、LAG-3、CD27、CD137、GITR、BTLA、CD3、CTLA-4、CD40、CD47、SIPRA、CD3e等。本专利技术的第一方面，涉及一种经遗传修饰的非人动物或其子代，所述动物的基因组中含有狗源PD-1基因，所述狗源PD-1基因通过所述动物内源性调控元件调控；其中，所述动物为除狗以外的非人动物。本专利技术还涉及一种经遗传修饰的非人动物或其子代，其特征在于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种经遗传修饰的非人动物或其子代，其特征在于，所述动物的基因组中含有狗源PD‑1基因，所述狗源PD‑1基因通过所述动物内源性调控元件调控；其中，所述动物为除狗以外的非人动物。

【技术特征摘要】
1.一种经遗传修饰的非人动物或其子代，其特征在于，所述动物的基因组中含有狗源PD-1基因，所述狗源PD-1基因通过所述动物内源性调控元件调控；其中，所述动物为除狗以外的非人动物。2.一种经遗传修饰的非人动物或其子代，其特征在于，所述动物体内表达狗或狗源化的PD-1蛋白，同时降低或消除了内源的PD-1蛋白的表达；其中，所述动物为除狗以外的非人动物。3.根据权利要求1或2所述的非人动物或其子代，其特征在于，所述动物基因组中PD-1基因包括编码胞外区、跨膜区以及胞内区的序列，其中，编码胞外区的序列包含狗源PD-1基因的全部或部分序列，编码胞内区和跨膜区的序列为动物来源，同时该动物来源部分和狗源PD-1基因序列通过序列拼接连接于所述动物内源的Pd-1基因启动子后。4.根据权利要求1-3任一所述的非人动物或其子代，其特征在于，所述除狗以外的非人哺乳动物为啮齿类动物；优选的，所述啮齿类动物为小鼠。5.一种经遗传修饰的细胞株，其特征在于，所述细胞株的基因组中含有狗源PD-1基因，所述狗源PD-1基因通过所述细胞株内源性调控元件调控；所述细胞株来源于除狗以外的非人动物。6.一种经遗传修饰的细胞株，其特征在于，所述细胞株表达狗或狗源化的PD-1蛋白，同时降低或消除了内源来源的PD-1蛋白的表达；所述细胞株来源于除狗以外的非人动物。7.根据权利要求5或6所述的细胞株，其特征在于，使用靶向Pd-1基因的载体将狗源PD-1基因导入到细胞株的Pd-1基因座中。8.根据权利要求5或6所述的细胞株，其特征在于，使用靶向Pd-1基因的载体将细胞株的Pd-1基因部分或全部替换为狗源PD-1基因的部分或全部制备获得。9.根据权利要求8所述的细胞株，其特征在于，使用靶向Pd-1基因的sgRNA将细胞株Pd-1基因的第2号外显子的全部或部分替换为狗源PD-1基因的部分或全部制备获得。10.根据权利要求5-9任一所述的细胞株，其特征在于，所述除狗以外的非人哺乳动物为啮齿类动物；优选的，所述啮齿类动物为小鼠。11.一种构建PD-1基因狗源化的非人动物或其子代的方法，其特征在于，包括导入狗源PD-1基因、使得该狗源PD-1基因在非人动物或其子代细胞中表达并且促进该细胞产生狗或狗源化的PD-1蛋白，同时降低或消除了非人动物或其子代的内源/动物来源的PD-1蛋白的表达；其中，所述动物为除狗以外的非人动物。12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的方法包括：(a)构建含有狗源PD-1基因的载体，通过基因编辑方法将所述狗源PD-1基因的载体导入非人动物的基因组中，使得非人动物基因组中的内源/动物来源的Pd-1基因缺失或降低/消除了内源/动物来源的PD-1蛋白的表达或内源/动物来源的PD-1蛋白不具有功能；并且(b)在所述非人动物或其子代体内表达狗/狗源化PD-1蛋白。13.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述动物基因组中包括狗源化PD-1基因，所述狗源化PD-1基因编码的蛋白包括胞外域、跨膜区和胞内区，其中，编码胞外域的狗源化PD-1基因包含狗源PD-1基因的全部或部分序列，编码胞内区和跨膜区的狗源化PD-1基因为动物来源，同时该动物来源部分和狗源PD-1基因部分通过序列拼接连接于动物内源Pd-1启动子后。14.根据权利要求11-13任一所述的方法，其特征在于，所述狗源PD-1基因的mRNA序列的全部或部分片段与SEQIDNO：3所示的序列具有至少大约70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或至少100％同一性程度的基因序列；所述狗PD-1蛋白序列的全部或部分片段与SEQIDNO：4所示的序列具有至少大约70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或至少100％同一性程度的基因序列。15.根据权利要求11-14任一所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)提供一种细胞，所述的细胞包含靶向动物Pd-1基因的靶向载体，和/或一种或多种靶向动物Pd-1基因的sgRNA，和/或一种或多种靶向动物Pd-1基因的sgRNA的体外转录产物；优选的，所述的细胞为受精卵细胞；2)将所述细胞在培养液中进行培养；3)将培养后细胞移植至受体雌性非人类哺乳动物的输卵管内，允许所述细胞在所述雌性非人类哺乳动物的子宫中发育；4)鉴定步骤3)怀孕雌性的后代在基因改造狗源化非人类哺乳动物中的种系传递。16.根据权利要求11-15任一所述的方法，其特征在于，使用基因编辑技术进行PD-1基因狗源化非人动物或其子代的构建，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的DNA同源重组技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术；优选的，使用基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术进行PD-1基因狗源化非人动物或其子代的构建。17.根据权利要求11-16任一所述的方法，其特征在于，使用靶向动物Pd-1基因的sgRNA将狗源PD-1基因片段的全部或部分导入动物Pd-1基因的第2号外显子位置。18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，使用靶向动物Pd-1基因的sgRNA将动物Pd-1基因的第2号外显子全部或部分替换为狗源PD-1基因的全部或部分。19.根据权利要求11-18任一所述的方法，其特征在于，所述除狗以外的非人哺乳动物为啮齿类动物；优选的，所述啮齿类动物为小鼠。20.根据权利要求17-19任一所述的方法，其特征在于，所述靶向动物Pd-1基因的sgRNA的5’端靶位点序列如SEQIDNO：18-21任一项所示，3’端靶位点序列如SEQIDNO：22-25任一项所示。21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述小鼠Pd-1基因的mRNA序列的全部或部分片段与SEQIDNO：1所示的序列具有至少大约70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或至少100％同一性程度的基因序列；所述小鼠PD-1蛋白序列的全部或部分片段与SEQIDNO：2所示的序列具有至少大约70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或至少100％同一性程度的基因序列。22.根据权利要求11-21任一所述的方法，其特征在于，所述动物基因组中包括嵌合PD-1基因，所述嵌合PD-1基因包括小鼠来源的Pd-1基因片段和狗源PD-1基因片段，所述嵌合PD-1基因序列的全部或部分与SEQIDNO：5所示的全部或部分序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或至少100％的同一性程度。23.根据权利要求11-22任一所述的方法，其特征在于，所述动物体内表达狗源化PD-1蛋白，所述的狗源化PD-1蛋白选自下列组中的一种：a)所述氨基酸序列如SEQIDNO：8所示；b)由核酸序列编码的氨基酸序列，所述核酸序列在低严谨条件下，与编码SEQIDNO：8所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；c)所述氨基酸序列与SEQIDNO：8所示的氨基酸的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；d)所述氨基酸序列与SEQIDNO：8所示的氨基酸的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；e)所述氨基酸序列具有SEQIDNO：8所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列；或f)所述氨基酸序列中狗PD-1蛋白的序列如SEQIDNO：4所示；g)所述氨基酸序列中狗PD-1蛋白的序列，在其核酸序列低严谨条件下，与编码SEQIDNO：4所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；h)所述氨基酸序列中狗PD-1蛋白的序列与SEQIDNO：4所示的氨基酸的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；i)所述氨基酸序列中狗PD-1蛋白的序列与SEQIDNO：4所示的氨基酸的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；j)所述氨基酸序列中狗PD-1蛋白的序列具有SEQIDNO：4所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列；或k)所述氨基酸序列中小鼠PD-1蛋白的序列如SEQIDNO：2所示；l)所述氨基酸序列中小鼠PD-1蛋白的序列，在其核酸序列低严谨条件下，与编码SEQIDNO：2所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；m)所述氨基酸序列中小鼠PD-1蛋白的序列与SEQIDNO：2所示的氨基酸的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；n)所述氨基酸序列中小鼠PD-1蛋白的序列与SEQIDNO：2所示的氨基酸的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；o)所述氨基酸序列中小鼠PD-1蛋白的序列具有SEQIDNO：2所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。24.根据权利要求11-22任一所述的方法，其特征在于，所述动物体内包含嵌合PD-1基因，所述的嵌合PD-1基因选自下列组中的一种：a)所述嵌合PD-1基因编码权利要求23中所述的狗源化PD-1蛋白序列；b)所述的嵌合PD-1基因序列的全部或部分如SEQIDNO：5所示序列的全部或部分；c)所述的嵌合PD-1基因的CDS编码序列如SEQIDNO：6所示；d)所述的嵌合PD-1基因转录的mRNA序列的全部或部分如SEQIDNO：7所示序列的全部或部分；e)所述的嵌合PD-1基因转录的mRNA序列与SEQIDNO：6或SEQIDNO：7所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；f)在低严谨条件下，与SEQIDNO：5或SEQIDNO：6或SEQIDNO：7所示的核苷酸序列杂交的基因序列；或g)所述的嵌合PD-1基因中狗源PD-1基因转录的mRNA序列如SEQIDNO：3所示；h)在低严谨条件下，所述的嵌合PD-1基因中狗源PD-1基因转录的mRNA序列为与SEQIDNO：3所示的核苷酸序列杂交的基因序列；i)所述的嵌合PD-1基因中狗源PD-1基因的序列转录的mRNA序列与SEQIDNO：3所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；或j)所述嵌合PD-1基因序列中鼠源序列转录的mRNA序列如SEQIDNO：1所示；k)所述嵌合PD-1基因序列中鼠源序列转录的mRNA序列在低严谨条件下，与SEQIDNO：1所示的核苷酸杂交的基因序列；l)所述嵌合PD-1基因序列中鼠源序列转录的mRNA序列与SEQIDNO：1所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列。25.一种由权利要求11-24任一所述的方法产生的非人动物或其子代。26.一种制备多基因狗源化动物或其子代的方法，其特征在于，包括(a)利用权利要求1-4、25任一所述的非人动物或其子代；(b)将步骤(a)所述的动物与其他狗源化动物交配、体外授精或直接进行基因编辑/修饰，并进行筛选，得到多基因狗源化动物或其子代。27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述多基因狗源化动物可以是双基因狗源化动物、三基因狗源化动物、四基因狗源化动物、五基因狗源化动物、六基因狗源化动物、七基因狗源化动物、八基因狗源化动物或九基因狗源化动物。28.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述的其他狗源化动物选自基因PD-L1，TIGIT、OX40、TIM-3、LAG-3、CD27、CD137、GITR、BTLA、CD3、CTLA-4、CD40、CD47、SIPRA、CD3e狗源化动物中的一种或两种以上。29.根据权利要求26-28任一所述的方法产生的多基因狗源化动物或其子代。30.一种靶向载体，其特征在于，其包含a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自Pd-1基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；b)插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；和c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自Pd-1基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。31.根据权利要求30所述的靶向载体，其特征在于，a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000067.6至少具有90％同源性的核苷酸；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000067.6至少具有90％同源性的核苷酸。32.根据权利要求31所述的靶向载体，其特征在于，与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自如NCBI登录号为NC_000067.6的第94041502-94043271位核苷酸；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段即3’臂，其选自如NCBI登录号为NC_000067.6的第94039436-94041168位核苷酸。33.根据权利要求32所述的靶向载体，其特征在于，所述5’臂序...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈月雷，白阳，黄蕤，周小飞，尚诚彰，张美玲，姚佳维，郭朝设，郭雅南，
申请(专利权)人：北京百奥赛图基因生物技术有限公司，百奥赛图江苏基因生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11