AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种AURKA‑CKO1‑N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，通过先构建重组打靶载体，线性化后转染胚胎干细胞，筛选发生同源重组的胚胎干细胞克隆，扩增后注入供体小鼠囊胚生产出嵌合体小鼠；嵌合体小鼠与flp小鼠交配获得阳性F1代小鼠；阳性F1代小鼠与组织特异性表达Cre重组酶的小鼠交配后，后代中获得具有AURKA‑CKO1‑N条件性基因敲除的小鼠模型。本发明专利技术所述的AURKA‑CKO1‑N条件性基因敲除小鼠模型，AURKA基因在特定组织和细胞类型中功能性缺失，为研究Aurora‑A在特定肿瘤发生发展中的作用机制提供理想模型。

Construction of AURKA-CKO1-N Conditional Gene Knockout Mice Model

The present invention relates to a construction method of AURKA CKO1 N conditional gene knockout mouse model. By constructing recombinant targeting vector, linearizing and transfecting embryonic stem cells, screening embryonic stem cell clones with homologous recombination, amplifying and injecting donor mouse blastocysts to produce chimeric mice, mating chimeric mice with FLP mice to obtain positive F1 mice; After mating with tissue-specific Cre recombinase-expressing mice, mice with AURKA CKO1 N conditional gene knockout model were obtained. The AURKA CKO1 N conditional gene knockout mouse model described in the present invention, and the functional deletion of AURKA gene in specific tissues and cell types, provide an ideal model for studying the mechanism of Aurora A in the occurrence and development of specific tumors.

【技术实现步骤摘要】
AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法。
技术介绍
基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的一门新技术。基因敲除的定义是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。Aurora-A是参与调控细胞有丝分裂的一类重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其编码基因定位于易位、缺失、扩增活跃的20q13.2染色体区域。意味着其表达模式具有天然的不稳定性。Aurora-A异常表达会引起细胞有丝分裂异常，进而导致基因组不稳定而诱发肿瘤形成。越来越多的研究显示，Aurora-A在结直肠癌、神经胶质瘤、乳腺癌、胰腺癌中异常高表达；此外，该区域扩增也被认为与患者预后不良有关。然而，Aurora-A参与肿瘤发生、发展的机制有待进一步阐明。然而，由于Aurora-A全身敲除小鼠容易造成小鼠胚胎致死。因此，构建条件性基因敲除小鼠模型为研究Aurora-A在肿瘤形成中的作用至关重要。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种AURKA‑CKO1‑N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)构建AURKA条件性基因敲除的重组打靶载体；(2)所述重组打靶载体经线性化后，转染胚胎干细胞；(3)筛选发生同源重组的胚胎干细胞克隆；(4)将筛选出的发生同源重组的阳性胚胎干细胞克隆经扩增后，注入供体小鼠的囊胚；(5)将含有阳性胚胎干细胞的囊胚移植到假孕小鼠的子宫，生产出嵌合体小鼠；(6)嵌合体小鼠与flp小鼠交配获得阳性F1代去Neo杂合子小鼠；(7)阳性F1代去Neo杂合子小鼠与组织特异性表达Cre重组酶的小鼠交配后，获得双杂合的小鼠；(8)雌性与雄性双杂合小鼠互交，后代中获得具有AURKA‑...

【技术特征摘要】
1.一种AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)构建AURKA条件性基因敲除的重组打靶载体；(2)所述重组打靶载体经线性化后，转染胚胎干细胞；(3)筛选发生同源重组的胚胎干细胞克隆；(4)将筛选出的发生同源重组的阳性胚胎干细胞克隆经扩增后，注入供体小鼠的囊胚；(5)将含有阳性胚胎干细胞的囊胚移植到假孕小鼠的子宫，生产出嵌合体小鼠；(6)嵌合体小鼠与flp小鼠交配获得阳性F1代去Neo杂合子小鼠；(7)阳性F1代去Neo杂合子小鼠与组织特异性表达Cre重组酶的小鼠交配后，获得双杂合的小鼠；(8)雌性与雄性双杂合小鼠互交，后代中获得具有AURKA-CKO1-N条件性基因敲除的小鼠模型。2.根据权利要求1所述的AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，采用Infusion方法构建所述重组打靶载体，具体操作如下：使用细菌人工染色体BAC打靶，将2个loxP位点分别插入到内含子2和内含子3，当Cre表达时敲除小鼠AURKA基因第3号外显子，并用Neo基因替换、造成移码突变，使蛋白翻译提前终止在第3号外显子；上游臂4.2kb，下游臂4.0kb，下游臂侧翼接磷酸甘油酸激酶启动子介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶负筛选标记基因基因表达框，最终得到AURKA-CKO同源重组打靶载体。3.根据权利要求1所述的AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述重组打靶载体包含4.2kb5’同源臂、0.6kb两侧引入重组酶Loxp位点区域、磷酸甘油酸激酶新霉素抗性正筛选标记基因、4.0kb3’同源臂和单纯疱疹病毒胸苷激酶负筛选标记基因。4.根据权利要求1所述的AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述重组打靶载体进行线性化的具体操作为：100μgAURKA-CKO同源重组打靶载体用酶用量300IU的NotI线性化，酶切体系为250μL，37℃消化过夜；之后用等体积的苯酚-三氯甲烷和...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨晶，郑葵阳，汤仁仙，
申请(专利权)人：徐州医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32