本发明专利技术涉及治疗性免疫的领域，特别涉及使用乙肝病毒(HBV)的抗原的新的制剂用于细胞刺激。所述制剂由HBV的悬浮液中沉淀的表面抗原(HBsAg)和核衣壳(HBcAg)构成。该制剂包含这些抗原的大小小于500nm和大于500nm的悬浮颗粒的混合物，其中所述大小的颗粒的比例分别是50％-50％和80％-20％。选择一定范围的大小的颗粒允许使数种细胞类型的刺激水平最大化。另外，描述了使用该制剂的细胞刺激方法和后续对患有慢性乙肝的患者的被动免疫，其是基于使用异源或自体细胞(树突细胞、B细胞和巨噬细胞)在体内或体外的最大化的刺激。以该制剂刺激的细胞被转移至慢性感染HBV的患者。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及医药，特别是通过转移已经经过こ肝病毒(HBV)的表面抗原(HBsAg)和核衣壳抗原(HBcAg)的制剂刺激的细胞而进行的治疗性免疫。通过包含这些抗原的混合物的制剂诱导细胞刺激，所述抗原从悬浮液中沉淀，其比例是基于在被动免疫治疗应用之前实现最大化细胞刺激而选择的。
技术介绍
世界卫生组织(WHO)认为世界上三分之一以上的人口已经被こ肝病毒(HBV)感染。认为5%至10%的成人和高达90%的被感染的新生儿是以持续方式产生感染，在世界水平而言有350，000，000人口携带该病毒。长时间段内HBV的持续复制导致进行性的肝病，其在大约25%的携帯者中进展为肝硬化或肝癌。认为每年有一百万以上的死亡与不同进展形式的该病毒的感染相关(Zuckerman JN. J MED VIROL 2006 ；78 :169-177)。使用缀合于聚こニ醇(PEG)的干扰素α (IFN-α)或其变体和核苷或核苷酸、例如拉米夫定、阿德福韦-ニ匹伏、恩替卡韦和Telbivudina进行的治疗构成了治疗慢性こ肝(CHB)的现有技木。一般地，就持续消除病毒而言，这些药物有效性差，并且它们的使用与严重的次级效应相关(Osborn MK, et to the one. J ANTIMICROB CHEM0THER. 2006 ；57 1030-34)。具有高百分率的预防こ肝的有效性的疫苗的开发构成了世界水平的预防医学的重大成就。目前，超过150个国家在免疫项目中向儿童、青少年和风险群体提供抗こ肝疫苗。第一代疫苗是基于从无症状携帯者的血浆获得的纯化且灭活的HBsAg。这些制剂是免疫原性的；但是，它们迅速被在酵母中产生的具有更高安全性的重组疫苗替代(ZuckermanJN. J MED VIROL 2006 ；78 :169-177)。目前，研究聚焦于免疫原性更高、更有效的制剂的开发，起始于强有力的佐剂的导入，但是这些制剂对于治疗慢性感染未获成功。从上世纪90年代开始，进行了 g在评估使用疫苗接种来治疗HBV慢性感染的研究。该治疗策略已经受到了强烈关注，其来自证实了免疫应答对于控制该病毒的基础性作用的证据。研究此课题的研究组寻求颠覆对于HBV的免疫耐受态，从施用疫苗制剂开始(Hui CK, et al. INT J MED SCI. 2005 ；2 :24-29)。最近，以治疗目的使用常规的预防性疫苗在免疫治疗领域获得的结果提示了研究使用更强有力的、包含新的抗原、佐剂、新施用途径和合理的组合治疗的疫苗候选物的必要性(Pol S，et al. Expert Rev Vaccines 2006 ；5 :707-16)。设计最佳疫苗候选物时应牢记与抗原性成分相关的方面，以及与制剂的佐剂成分相关的方面。遗传工程与生物技术中心(CIGB)使用酵母“巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris) ”作为宿主细胞生产了重组HBsAg。该抗原是古巴从九十年代初期批准和使用的抗こ肝疫苗的一部分(Muzio V, et al. European patent No. EP 480525)。HBsAg具有在健康人中诱导强烈的特异性免疫应答(抗体的和辅助性T细胞的)的能力。另外，已经证明HBsAg表位可以由I类主要组织相客性系统(HLA)的分子呈递，即使是当该蛋白像异源蛋白一祥被抗原呈递细胞加工的时候。该性质允许非佐剂化的HBsAg通过经替代性加工途径产生的表位诱导细胞毒性应答，允许HBsAg特异性细胞毒性细胞库的扩增(Bertoletti A，J Hepatol 2003 ；39 :115-124)。然而，该抗原在治疗性免疫中的使用未在II期研究中产生可重现的益处。目前，尚不存在针对HBV慢性感染的治疗性疫苗。用于促进慢性患者中的免疫应答的策略之ー是使用HBcAg作为疫苗抗原。HBcAg的氨基酸序列的显著特性是在羧基末端存在富含精氨酸的区域。该区域具有在天然颗粒中连接前基因组核糖核酸(RNA)的功能。在重组颗粒的情况下，该区域与细菌RNA(大小为30-3000个核苷酸)结合，这赋予了重要的免疫性质(Riedl P. J Immunol 2002 ; 168 :4951-59)。治疗HBC时的“免疫治疗”的概念暗示了缺陷性免疫应答的重激活，目标是控制病毒复制和消除或控制感染。在骨髄移植研究中已经直接验证了该概念。可以证明，来自具有针对HBV的免疫力的供体的细胞的骨髄移植至被该病毒慢性感染的受体时，该程序能够治愈受体患者的慢性感染(Lau GK, Gastroenterology 2002 ；122 :614-24 ；SH0UVALD，ILAN Y. J HEPATOL 1995;23:98-101)。然而，使用商售疫苗免疫对HBV无免疫的供体(non-immune donor)未在受体患者骨髓淋巴细胞中产生治疗性应答,这使得该治疗策略的エ业应用产生了巨大的局限性，因为其依赖于供体的天然感染。在被HBV慢性感染的过程中，在效应子细胞和专职抗原呈递细胞中，T和B效应子细胞的应答是差的、缺失的或功能上有缺陷的。然而，产生自我限制或急性感染的患者显示出针对表面蛋白、核衣壳和聚合酶的多克隆和多特异性的強烈的细胞毒性和辅助性应答(Webster GJ, J Virol 2004 ;78 :5707-19)。另ー方面，在慢性感染过程中，被不同病毒抗原刺激的外周血的淋巴细胞分泌的Thl相关的细胞因子的水平非常差，与急性感染时的情况正相反(Jung MC. Virologyl999 ；261 :165-72 ；PENNA A, HEPAT0L0GY 1997 ；25 :1022-27)。这些发现提示促进特异性免疫应答能构成治疗替代方案。另ー项有趣的发现是JAHBC自发复原的患者，或对于IFN- α治疗有应答的患者，能够产生强度类似于产生急性感染的患者的细胞毒性应答(Rehermann B, J Clin Invest1996 ；97 =1655-65)。另外，证明了以拉米夫定治疗的患者中的⑶4+和⑶8+细胞应答的水平的升高，这提示可以从病毒的持续抑制出发，诱导免疫应答(Boni C，Hepatology 2001 ； 33 :963-71 ；Β0ΝΙ C，J HEPATOL 2003 ；39 :595-605)。在免疫治疗策略中，治疗性疫苗接种构成了 1990年代治疗被HBV慢性感染的患者时应用的替代方案。主要的免疫治疗策略着眼于表面和病毒核衣壳抗原的使用。通过过继转移(adoptive transfer)的方式证明了针对HBcAg的细胞免疫カ在控制こ肝慢性感染中的重要性。在患有CHB、接受免疫供体的骨髓细胞的过继转移的患者中进行的研究证明可以消除这些患者的血清中的HBsAg。能够通过此治疗消除HBsAg的患者的研究证明了 HBV慢性感染的消除与特异于HBcAg的⑶4+T淋巴细胞的转移相关(Chee-KinH, Int J Med Sci 2005 ；2 :24-29)。使用抗原呈递细胞的免疫治疗树突细胞是免疫系统的专职抗原呈递细胞，其指令并控制T和B淋巴细胞(特异性免疫力的介导者)的激活。从1996年直至2004年，使用载入了肿瘤抗原或以肿瘤抗原脉冲化处理本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.09.29 CU 2009-01641.こ肝病毒(HBV)的表面(HBsAg)和核衣壳(HBcAg)抗原的制剂，其特征在于，其包含所述抗原的悬浮液中的沉淀物。2.权利要求I的制剂，其中悬浮液中的沉淀物构成大小小于500nm和大于500nm的颗粒的混合物。3.权利要求2的制剂，其中大小小于500nm和大于500nm的颗粒的比例分别为50% -50%至 80% -20%。4.权利要求I的制剂，其中悬浮液中的沉淀物通过使这些抗原的混合物经历酸沉淀而获得。5.权利要求4的制剂，其中通过以酸溶液进行透析或渗滤而进行酸沉淀。6.获得こ肝病毒(HBV)的表面(HBsAg)和核衣壳(HBcAg)抗原的制剂的方法，所述制剂由这些抗原的悬浮液中的沉淀物构成，所述方法的特征在于a)制备HBsAg和HBcAg抗原的混合物山)使该混合物经历酸沉淀；和c)根据它们的大小、按照它们对于异源或自体抗原呈递细胞产生最大的体内或体外刺激的方式选择沉淀物。7.权利要求6的方法，其中经历酸沉淀的混合物中的HBsAg和HBcAg抗原的浓度是0. l_2mg/mL 蛋白。8.权利要求6的方法，其中通过以酸溶液进行透析或渗滤而进行酸沉淀。9.权利要求8的方法，其中用于透析或渗滤的酸溶液是こ酸，优选为pH4. O的50mM的こ酸。10.权利要求8的方法，其中酸沉淀持续10分钟至24小时。11.权利要求6的方法，其中沉淀物的颗粒的大小按照如下方式选择使得那些大小小于500nm和大于500nm的颗粒的比例分别为50% -50%至80% -20%。12.用于被动免疫治疗的细胞刺激方法，其特征在于刺激剂是由こ肝病毒(HBV)的HBsAg和HBcAg抗原的悬浮液中的沉淀物构成的制剂。13.权利要求12的方法，其中悬浮液中的沉淀物构成大小小于500nm和大...
【专利技术属性】
技术研发人员：J·阿古拉鲁比多，Y·洛拜纳马托，D·赫南德兹尹古安佐，H·特鲁吉洛佩尔兹，F·D·L·M·弗雷尔阿尔梅达，V·L·穆兹欧冈萨雷斯，E·潘顿阿利亚斯，S·冈萨雷斯布兰克，R·乌比塔戈麦斯，G·E·吉伦涅托，L·S·赫里拉马丁内斯，
申请(专利权)人：遗传工程与生物技术中心，
类型：发明
国别省市：
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