基于高通量测序的鳓鱼SNP标记开发方法及应用技术

本发明专利技术公开了基于高通量测序的鳓鱼SNP标记开发方法及应用，鳓鱼SNP标记开发方法包括提取基因组DNA、RAD文库构建与高通量测序、原始序列数据过滤、SNP信息位点检测与筛选；在提取基因组DNA过程中加入环状DNA和甲壳质，能有效提高SNP标记筛选准确度和获取效率；用该方法获得的鳓鱼高密度SNP位点可用于研究鳓鱼的种群遗传结构，对阐明种群对本地环境的适应性机制，以及鳓鱼资源的合理开发利用和管理保护提供重要的科学指导，对衰退种质资源的补充和生态系统的健康发展都具有重要的科学意义。有益效果：本发明专利技术获取鳓鱼高密度SNP标记位点的方法具有简单、高效、SNP标记筛选获取效率高、重复性好、成本低等优点。

Development and application of SNP markers for sole based on high-throughput sequencing

The invention discloses the development method and application of SNP markers for sole fish based on high-throughput sequencing. The development method of SNP markers for sole fish includes extraction of genomic DNA, construction of RAD library and high-throughput sequencing, filtering of original sequence data, detection and screening of SNP information sites; adding cyclic DNA and chitin in the process of extracting genomic DNA can effectively improve the screening accuracy and acquisition efficiency of SNP markers; The high-density SNP loci obtained by this method can be used to study the genetic structure of the population of sole, and provide important scientific guidance for elucidating the adaptive mechanism of the population to the local environment, as well as for the rational exploitation, utilization and management and protection of sole resources. It is also of great scientific significance for the supplement of declining germplasm resources and the healthy development of ecosystems. Beneficial effect: The method for obtaining high density SNP marker loci of sole has the advantages of simplicity, high efficiency, high efficiency of SNP marker screening, good repeatability and low cost.

【技术实现步骤摘要】
基于高通量测序的鳓鱼SNP标记开发方法及应用
本专利技术涉及分子生物学
，尤其是涉及基于高通量测序的鳓鱼SNP标记开发方法及应用。技术背景鳓鱼(Ilishaelongate)，属于鲱形目(Clupeiformes)，锯腹鳓科(Pristigasteridae)，鳓属(Ilisha)，为我国沿海广泛分布的暖水性中上层重要经济鱼类，渤海、黄海、东海、南海均有产出，产量最多的海域位于东海。鳓鱼以浮游生物为主，包括硅藻类、小型游泳动物(幼鱼)、桡足类、磷虾类、长尾类和糠虾类等，兼食底栖生物和小型游泳动物，同时又是多种高营养级鱼类的捕食对象，在海洋生态系统食物链中发挥着承上启下的重要作用。同时，鳓鱼含肉率高、肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富，是我国传统名贵鱼类，鳓鱼的干制品，如广东的曹白鱼鲞、浙江的糟鲞已久负盛名；而且鳓鱼也是中国出口创汇的重要水产品之一。近年来受过度捕捞、全球气候变化、环境污染和栖息地破坏等影响，使得鳓鱼野生群体数量大大减少，长此以往势必会对鳓鱼的遗传多样性和种质资源造成巨大破坏，产生难以估量的损失。由于其不仅是重要的渔业捕捞对象，还是海洋生态系统变动的关键指示种，在物质循环和能量流动中发挥不可替代的作用，鳓鱼资源的衰退不仅会造成其自身渔业产量的大幅减少，而且还会破坏整个沿海生态系统的物质能量循环网结构。因此，加强对鳓鱼资源的管理和保护刻不容缓。群体遗传学研究对于正确理解与种群适应性、持续性及种群动态相关的生态与进化过程至关重要，是制定有效保护和合理开发利用生物资源策略的基础。研究鳓鱼的种群遗传结构，阐明种群对本地环境的适应性机制，可为鳓鱼资源的合理开发利用和管理保护提供重要的科学指导，对衰退种质资源的补充和生态系统的健康发展都具有重要的科学意义。单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism，SNP)指的是某种生物不同个体DNA序列中单个核苷酸点突变产生的多态性，包括置换、颠换、插入或缺失引起的多态现象。SNP是由美国学者Lander于1996年提出的继RFLP、SSR的第三代新型分子标记技术，1998～2002年每年都召开“SNPs与复杂基因组”国际会议以探讨SNPs在复杂基因组中应用，随着PCR、分型检测、DNA芯片等技术的不断发展，SNP趋于高通量、自动化。近年来，分子标记技术逐渐成为研究水产动物遗传学的重要手段，SNP作为第三代遗传标记，位点数量多、密度广、遗传多样性高以及自动化程度强，能够显示其他分子标记技术难以检测到的遗传信息多态性，故而，SNP标记技术对于水产动物遗传学研究具有重要意义。基于先进的简化基因组测序技术获得高密度的SNP位点，可从全基因组层面查明中国沿海黄鲫种群的遗传多样性水平、种群遗传结构等重要群体遗传学参数，能够克服传统方法中依赖于单个或少数基因位点来评估海洋生物群体遗传和进化机制带来的不确定性和分辨率不高的问题，将为黄鲫的有效管理及合理保护提供背景知识，并有助于推动中国海洋鱼类群体基因组学研究向更深发展。目前获取基因信息数据的方法主要有两种：基因分型和基因测序。基因分型主要是利用已知的单核苷酸多态性(SNP)位点侧翼的碱基序列设计探针，并将探针固定在基因芯片上。当待测样本的DNA与基因芯片上的探针序列互补杂交并通过扫描荧光信号来探知杂交，便可鉴定样本DNA上这些探针位点(SNP位点)的基因型。而基因测序是对目标DNA进行碱基序列测定，并进行相关分析。现有技术如授权公告号为CN105238859B的中国专利技术专利，公开了一种获取鸡全基因组高密度SNP标记位点的方法，包括以下步骤：(1)预测用EcoRI与MseI的双酶切鸡基因组所获得的酶切片段分布情况；(2)根据EcoRI与MseI的酶切片段分布特点设计通用接头、条形码接头及PCR扩增引物；(3)构建简化基因组测序文库；(4)利用步骤(3)构建的文库进行上机测序；(5)根据测序结果获得SNP标记位点；该专利技术获取每个SNP标记位点的成本比传统芯片技术降低一个数量级，且方法技术稳定，重复性高。然而该专利技术测序程序较复杂，目标DNA获取纯度低。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于高通量测序的鳓鱼SNP标记开发方法，该方法具有简单、高效、SNP标记筛选获取效率高、重复性好、成本低等优点；采用该方法对鳓鱼SNP标记开发，可用于研究鳓鱼的种群遗传结构，对阐明种群对本地环境的适应性机制，以及鳓鱼资源的合理开发利用和管理保护提供重要的科学指导，对衰退种质资源的补充和生态系统的健康发展都具有重要的科学意义。本专利技术针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：基于高通量测序的鳓鱼SNP标记开发方法，包括以下步骤：提取基因组DNA：提取用溶液包括提取液I和提取液II；其中提取液I包括缓冲盐、非离子表面活性剂、以及中性盐的水溶液，其pH值为7.5-8.5；提取液II包括缓冲盐和阳离子表面活性剂，其pH值为7.8-8.2；具体步骤为：将鳓鱼肌肉或鳍条组织样品剪碎，置于提取液I，加入环状DNA和甲壳质，冻融2-3次，离心，收集上清液后加入提取液II，颠倒混匀后，离心产生白色沉淀，洗涤沉淀得DNA样品，待用；RAD文库构建与高通量测序：采用限制性内切酶EcoRI对基因组DNA进行酶切，向酶切片段中加入第一接头，将所得DNA片段混池，打断，通过琼脂糖凝胶电泳回收350-550bp的DNA片段，对所得DNA片段进行末端平化，3’端加“A”，接着加入第二接头，第二接头为分叉的Y型接头，可阻止未连接第一接头的片段扩增，得DNA模板，通过桥式PCR扩增所制备的DNA模板，成簇后应用IlluminaHiSeq4000测序平台进行双端测序；该过程不受参考基因组的限制，可简化复杂基因组，能够在整个基因组内批量寻找SNP位点，具有一致的扩增效率，有效地降低了建库成本和测序成本；原始序列数据过滤：过滤掉原始测序数据中包含带Adaptor信息、低质量碱基和未测出的碱基的readspair；原始测序数据中所包含的这些信息会对后续的信息分析造成很大的干扰，分析前将这些干扰信息去除掉，所得到的有效数据为后续数据的精确分析提供了保证；SNP信息位点检测与筛选：将过滤所得的readspair通过BWA软件与已发表的鳓鱼基因组草图进行比对，接着采用SAMTOOLS0.1.19中的贝叶斯算法模型以最大reads深度为1000的参数设置进行SNP的检测，过滤得鳓鱼SNP标记位点；利用获得的鳓鱼SNP标记位点对鳓鱼群体进行遗传学分析：本研究总共筛选出了77,634个高质量的多态SNPs，如图1，其中42,447个SNP来自于碱基间的转换(A/G、C/T)，35,187个SNP来自于碱基间的颠换(A/C、A/T、C/G及G/T)，也就是说，这些SNP中54.70％是由碱基之间的转换产生的，45.30％是由碱基之间颠换产生的；同时，我们也发现A/G的数量最为丰富(27.50％)，C/G的数量最少(6.16％)。作为优选，环状DNA为高纯度的细菌质粒DNA；可根据需要选用不同大小的环状DNA，只要所加环状DNA与所构建的目标DNA文库能够有效分离即可；环状DNA和甲壳质的特殊存在，一方面能够促进鳓鱼组织细胞中水分子与非离子表面活性剂结合，发生水合作本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于高通量测序的鳓鱼SNP标记开发方法，包括提取基因组DNA、RAD文库构建与高通量测序、原始序列数据过滤、SNP信息位点检测与筛选，其特征在于：所述提取基因组DNA的步骤为：将鳓鱼肌肉或鳍条组织样品剪碎，置于提取液I，加入环状DNA和甲壳质，冻融，离心，收集上清液后加入提取液II，颠倒混匀后，离心产生白色沉淀，洗涤沉淀得DNA样品，待用。

【技术特征摘要】
1.基于高通量测序的鳓鱼SNP标记开发方法，包括提取基因组DNA、RAD文库构建与高通量测序、原始序列数据过滤、SNP信息位点检测与筛选，其特征在于：所述提取基因组DNA的步骤为：将鳓鱼肌肉或鳍条组织样品剪碎，置于提取液I，加入环状DNA和甲壳质，冻融，离心，收集上清液后加入提取液II，颠倒混匀后，离心产生白色沉淀，洗涤沉淀得DNA样品，待用。2.根据权利要求1所述的基于高通量测序的鳓鱼SNP标记开发方法，其特征在于：所述环状DNA为高纯度的细菌质粒DNA。3.根据权利要求1所述的基于高通量测序的鳓鱼SNP标记开发方法，其特征在于：所述提取液I包括缓冲盐、非离子表面活性剂、以及中性盐的水溶液，其pH值为7.5-8.5；提取液II包括缓冲盐和阳离子表面活性剂，其pH值为7.8-8.2。4.根据权利要求1所述的基于高通量测序的鳓鱼SNP标记开发方法，其特征在于：所述RAD文库构建与高通量测序的步骤为：采用限制性内切酶EcoRI对基因组DNA进行酶切，向酶切片段中加入第一接头，将所得DNA片段混池，打断，通过琼脂糖凝胶电泳回收350-550bp的DNA片段，对所得DNA片段进行末端平化，3’端加“A”，接着加入第二接头，得DNA模板，通过桥式PCR扩增所制备的DNA模板，成簇后应用IlluminaHiSeq4000测序平台进行双端测序。5.根据权利要求4所述的基于高通量测序的鳓鱼SNP标记开发方法，其特征在于：所述RAD文库构建与高通量测序中酶切反应体系为40-50μL，其中含有1-2μL10×...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘炳舰，吕振明，柳意樊，刘立芹，龚理，江丽华，张伟男，朱科桦，刘珠，段雯，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33