一种维持和回复毛乳头细胞干性的外泌体制剂制造技术

本发明专利技术公开了一种维持和回复毛乳头细胞干性的外泌体制剂，该制剂通过以下方法制得：1）DPC的分离获取；2）外周血单个核细胞的分离；3）CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞筛选；4）CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞条件培养基的获取；5）DPC诱导培养基的配置；6）DPC的诱导培养；7）外泌体制剂的制备。该方法避免CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞在直接应用（细胞移植）中的免疫排斥和替代方法(transwell)中的共培养成本费用高的问题，在DPC培养中能回复高代次毛乳头的细胞干性。

A secretory agent that maintains and restores the dryness of dermal papilla cells

The invention discloses an exosome preparation for maintaining and restoring the dryness of dermal papilla cells, which is prepared by the following methods: 1) isolation and acquisition of DPC; 2) isolation of peripheral blood mononuclear cells; 3) screening of CD4 + CD25 + Foxp3 + Treg cells; 4) acquisition of CD4 + CD25 + Foxp3 + Treg cell conditioned medium; 5) configuration of DPC induction medium; 6) induction and culture of DPC; 7) exosome; Preparation of preparation. This method avoids the high cost of co-culture of CD4 + CD25 + Foxp3 + Treg cells in direct application (cell transplantation) of immune rejection and alternative methods (transwell). It can restore the dryness of high generation dermal papilla cells in DPC culture.

【技术实现步骤摘要】
一种维持和回复毛乳头细胞干性的外泌体制剂
本专利技术属于生物技术
，具体涉及一种维持和回复毛乳头细胞干性的外泌体制剂。
技术介绍
毛乳头细胞（DPC）对毛囊生长至关重要，可发出信号启动毛囊发育和毛发的周期性更替。目前常见的男女脱发都表现为包括毛乳头组织在内的进行性毛囊微型化，导致毛发生长周期缩短，毛囊周期紊乱，生长期缩短，毛发变稀疏、变短。目前有研究者分离出对毛囊再生起关键作用的DPC，发现体外培养条件下，代数较低的较原始的DPC呈聚集性生长，表达碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase，ALP）和α-平滑肌蛋白（α-SMA）等特有的标记分子。随传代次数增加，ALP和α-SMA的表达降低，DPC的干性（分化能力）和诱导毛发发育及再生的能力或逐渐消失。同时由于毛囊样本来源于人体，样本较难得，已经DPC制备获取过程繁琐，这就给毛囊部位DPC的研究带来困难。针对这一问题，有学者利用培养过低传代DPC的条件培养基成分来培养高传代DPC，发现其中的Wnt10b等成分可以逆转高传代DPC的细胞干性，但对其中的有效成分进行分析获知，不同批次细胞间有效成分的表达水平有差异，实际应用时效果不稳定。另，国外研究发现，CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞通过旁分泌Jag1蛋白，上调毛囊干细胞中的Notch信号通路的表达，活化在毛囊再生中发挥中枢作用的DPC（包括WNT信号通路得激活等），进而启动毛囊再生；在毛发进入生长期前，去除CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞会阻断毛发再生。但想直接通过细胞移植的方法将T细胞应用在临床脱发治疗中存在伦理难通过，机体免疫源性高等方面的问题；而且想通过常规的共培养方式，如transwell共培养来回复高传代DPC的干性，存在着成本极高的问题。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术设计的目的在于提供一种维持和回复毛乳头细胞干性的外泌体制剂。本专利技术通过以下技术方案加以实现：所述的一种维持和回复毛乳头细胞干性的外泌体制剂，其特征在于该制剂采用以下方法制备和应用：1）DPC的分离获取，采集患者后枕部区域单位毛囊组织，采用改良二步酶消化法进行实验室DPC的分离培养；2）外周血单个核细胞的分离，抽取肝素抗凝静脉血30mL，取6个15mL离心管，每管小心加入淋巴细胞分离液5mL，将5mL外周血沿管壁缓慢置于淋巴细胞分离液层面之上，2000r/min20℃离心20min，收集淋巴细胞层中的淋巴细胞，PBS洗涤2次备用；3）CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞筛选，MACS分选上述步骤获得的外周血单个核细胞进行细胞计数，加PBS洗涤，1200r/min离心后弃上清，以MACSbuffer90μL/每107个细胞重悬，加入CD4+T细胞Biotin⁃Antibody10μL/每107个细胞，混匀，进行第一次孵育，第一次孵育结束后加入20μLAnti⁃BiotinMicroBeads/每107个细胞，混匀，进行第二次孵育，第二次孵育结束后，以MACSbuffer将细胞调整至500μL体积，过LD柱，收集过柱后流下来的细胞悬液为CD4+T细胞（阴选），将细胞洗涤离心后，以MACSbuffer90μL/每107个细胞重悬，加入CD25MicroBeads，混匀，进行第三次孵育，第三次孵育结束后，加入1-2mLMACSbuffer洗涤离心，弃去上清，重悬至500μL，过MS柱，把separator移开，放置1mLMACSbuffer于MS柱上，迅速将细胞打下，收集流下的为CD4+CD25+T细胞（阳选）；4）CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞条件培养基的获取，将筛选获取的CD4+CD25+Treg细胞接种于细胞培养袋，培养15d后，吸取培养基于250ml离心管，800g离心10min，上清液即为CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞条件培养基；5）DPC诱导培养基的配置，将步骤4）中所获取的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞条件培养基与DPC培养基混合，所得培养基即为DPC诱导培养基；6）DPC的诱导培养，待第三代DPC铺满率为70%时，换DPC培养基为DPC条件培养基，培养48h后，更换培养基为DMEM基础培养基；7）外泌体制剂的制备，在不含血清的DMEM基础培养基中培养48h后，收集细胞培养上清液，经超速离心法获取外泌体；用生理盐水或DMEM溶解为含DPC外泌体浓度为1*1010颗粒/ml的溶液，即得外泌体制剂；其中，外泌体制剂培养基的制备，将外泌体制剂按1:49的比例添加于DPC培养基（基础培养基+10%胎牛血清+10ng/mlEGF+10ng/mlbFGF）即得外泌体制剂培养基。所述的一种维持和回复毛乳头细胞干性的外泌体制剂，其特征在于步骤1）中改良二步酶消化法的步骤为：1）经过手术后的单个毛囊置于毛囊采集液中于4℃环境保存，用含1%双抗的PBS溶液清洗毛囊组织2～3次；2）显微镜下用1ml注射器针头将毛球部组织整个分离出来，将残留的毛母质清除干净，用移液枪将组织移至新的含PBS溶液的培养皿中；3）将PBS清洗一次后加入0.2%胶原酶IV，在37℃温度下消化1h～2h，间隔10min观察消化状态，同时用吸管吹打组织，待有毛乳头组织周边的真皮鞘组织全部解离出来后，在显微镜下用移液枪挑选出单个毛乳头组织，放置入一个新的培养皿中；4）DPC的贴壁培养：将步骤1）中获得的毛乳头组织进行贴壁培养：毛乳头组织在37℃、5%CO2培养箱中进行贴壁培养，待组织全部贴壁并有细胞爬出后更换培养基，以后每间隔3天更换一次培养基，待细胞生长融合达到80%进行消化收集获取原代DPC。所述的一种维持和回复毛乳头细胞干性的外泌体制剂，其特征在于4）中培养基为：基础培养基+10%胎牛血清+10ng/mlEGF+10ng/mlbFGF。所述的一种维持和回复毛乳头细胞干性的外泌体制剂，其特征在于步骤3）中第一次孵育、第二次孵育、第三次孵育的温度均为2-8℃，第一次孵育时间为5min，第二次孵育时间为10min，第三次孵育时间为15min。所述的一种维持和回复毛乳头细胞干性的外泌体制剂，其特征在于步骤5）中DPC诱导培养基中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞条件培养基体积占比为30%-70%，优选的DPC诱导培养基中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞条件培养基体积占比为50%；所述的一种维持和回复毛乳头细胞干性的外泌体制剂，其特征在于DPC细胞培养上的应用。本专利技术与现有技术相比，具有以下有益效果：1）针对CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞可以激活毛囊再生，对CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞进行培养后收集其细胞条件培养基，过滤去除大的细胞膜碎片，然后作用于DPC。本方法避免CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞在直接应用（细胞移植）中的免疫排斥和替代方法(transwell)中的共培养成本费用高的问题；2）本专利技术采用特定的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞条件培养基进行刺激诱导，有利于DPC分泌特定的对毛囊再生起作用的成分，一定程度上减少外泌体的用量，减少外泌体其他成分的副作用；3）本专利技术采用特定的CD4+CD25+Foxp3+Tre本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种维持和回复毛乳头细胞干性的外泌体制剂，其特征在于该制剂采用以下方法制备：1）毛乳头细胞（DPC）的分离获取，采集患者后枕部区域单位毛囊组织，采用改良二步酶消化法进行实验室DPC的分离培养；2）外周血单个核细胞的分离，抽取肝素抗凝静脉血30mL，取6 个15mL离心管，每管小心加入淋巴细胞分离液5mL，将5mL 外周血沿管壁缓慢置于淋巴细胞分离液层面之上，2000r/min 20℃离心20min，收集淋巴细胞层中的淋巴细胞，PBS 洗涤2次备用；3）CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞筛选，MACS 分选上述步骤获得的外周血单个核细胞进行细胞计数，加PBS洗涤，1200r/min 离心后弃上清，以MACS buffer 90μL/每107个细胞重悬，加入CD4+T 细胞Biotin⁃Antibody10μL/每107个细胞，混匀，进行第一次孵育，第一次孵育结束后加入20μLAnti⁃Biotin MicroBeads/每107个细胞，混匀，进行第二次孵育，第二次孵育结束后，以MACS buffer将细胞调整至500μL体积，过LD柱，收集过柱后流下来的细胞悬液为CD4+T 细胞（阴选），将细胞洗涤离心后，以MACS buffer 90μL/每107个细胞重悬，加入CD25MicroBeads，混匀，进行第三次孵育，第三次孵育结束后，加入1‑2mL MACS buffer 洗涤离心，倾去上清，重悬至500μL，过MS 柱，把separator移开，放置1mL MACSbuffer于MS 柱上，迅速将细胞打下，收集流下的为CD4+CD25+T细胞（阳选）；4）CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞条件培养基的获取，将筛选获取的CD4+CD25+Treg细胞接种于细胞培养袋，培养15d后，吸取培养基于250ml离心管，800g离心10min，上清液即为CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞条件培养基；5）DPC诱导培养基的配置，将步骤4）中所获取的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞条件培养基与DPC培养基混合，所得培养基即为DPC诱导培养基；6）DPC的诱导培养，待第三代DPC铺满率为70%时，换DPC培养基为DPC诱导培养基，培养48h后，更换培养基为DMEM基础培养基；7）外泌体制剂的制备，在不含血清的DMEM基础培养基中培养48h后，收集细胞培养上清液，经超速离心法获取外泌体；用生理盐水或DMEM溶解为含DPC外泌体浓度为1*1010颗粒/ml的溶液，即得外泌体制剂。...

【技术特征摘要】
1.一种维持和回复毛乳头细胞干性的外泌体制剂，其特征在于该制剂采用以下方法制备：1）毛乳头细胞（DPC）的分离获取，采集患者后枕部区域单位毛囊组织，采用改良二步酶消化法进行实验室DPC的分离培养；2）外周血单个核细胞的分离，抽取肝素抗凝静脉血30mL，取6个15mL离心管，每管小心加入淋巴细胞分离液5mL，将5mL外周血沿管壁缓慢置于淋巴细胞分离液层面之上，2000r/min20℃离心20min，收集淋巴细胞层中的淋巴细胞，PBS洗涤2次备用；3）CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞筛选，MACS分选上述步骤获得的外周血单个核细胞进行细胞计数，加PBS洗涤，1200r/min离心后弃上清，以MACSbuffer90μL/每107个细胞重悬，加入CD4+T细胞Biotin⁃Antibody10μL/每107个细胞，混匀，进行第一次孵育，第一次孵育结束后加入20μLAnti⁃BiotinMicroBeads/每107个细胞，混匀，进行第二次孵育，第二次孵育结束后，以MACSbuffer将细胞调整至500μL体积，过LD柱，收集过柱后流下来的细胞悬液为CD4+T细胞（阴选），将细胞洗涤离心后，以MACSbuffer90μL/每107个细胞重悬，加入CD25MicroBeads，混匀，进行第三次孵育，第三次孵育结束后，加入1-2mLMACSbuffer洗涤离心，倾去上清，重悬至500μL，过MS柱，把separator移开，放置1mLMACSbuffer于MS柱上，迅速将细胞打下，收集流下的为CD4+CD25+T细胞（阳选）；4）CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞条件培养基的获取，将筛选获取的CD4+CD25+Treg细胞接种于细胞培养袋，培养15d后，吸取培养基于250ml离心管，800g离心10min，上清液即为CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞条件培养基；5）DPC诱导培养基的配置，将步骤4）中所获取的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞条件培养基与DPC培养基混合，所得培养基即...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁博，陈锦阳，刘军权，
申请(专利权)人：浙江卫未生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33