全悬浮培养PK15细胞株的获得及其应用本发明专利技术公开了一株经过驯化培养的全悬浮PK15细胞株及其在疫苗病毒生产中的应用，属于生物技术领域。本发明专利技术公开的全悬浮培养PK15细胞，命名为猪肾PK15‑U悬浮细胞，已于2018年03月21日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201860。本发明专利技术公开的利用PK15‑U悬浮细胞培养疫苗病毒的方法，与现有技术相比，自动化程度高，不需要载体介入，可以在无血清或低血清培养基中悬浮培养，解决了病毒培养大规模产业化的要求，开发能满足GMP生产技术要求的大规模化生产方法，拥有很好的工业化应用前景。
【技术实现步骤摘要】
全悬浮培养PK15细胞株的获得及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一株适应全悬浮培养的PK15细胞及其应用。
技术介绍
PK15细胞来源于猪肾，中文名为猪肾上皮细胞，其父母代源自1955年美国Stice提供的成年猪肾细胞PK-2a。PK15对猪圆环病毒（PCV）、猪细小病毒（PPV）和猪瘟病毒（CSFV）等多种病毒比较敏感，现已广泛应用于猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒等的分离、体外培养以及相关疫苗的生产中。传统PK15细胞呈贴壁依赖性生长，目前上述病毒培养大多数采用转瓶培养方式，但由于转瓶数量众多，占用车间面积大、手工操作、生产效率低下，且细胞密度低，因此悬浮培养成为兽用疫苗技术和质量发展瓶颈。1962年，Capstick等对BHK-21细胞驯化实现悬浮培养并用于兽用疫苗生产。1967年，VanWezel开发了微载体并实现在生物反应器中大规模培养贴壁细胞。悬浮培养与微载体培养标志着细胞大规模培养技术的开始，细胞生产病毒疫苗也成为细胞大规模培养技术生产生物制品的第一次浪潮。目前生物反应器细胞悬浮培养已然成为目前疫苗工业自动化生产工艺的研究主力。微载体培养由于所需微载体成本高，培养过程中细胞需要消化等步骤，不能像全悬浮培养一样线性化放大，制约了微载体培养在工业化生产中的应用；与微载体培养PK-15细胞相比，PK15细胞的全悬浮培养技术由于其成本低，易线性放大，已成为当前一些病毒疫苗大规模生产的首选。目前针对PK-15细胞贴壁培养进行全悬浮培养驯化的研究很多，但未发现有成功驯化出PK-15全悬浮培养细胞株并应用于猪圆环病毒疫苗生产的公开报道。专利
技术实现思路
本专利技术的重要意义在于，提供一株适应全悬浮培养的细胞株PK15-U及其在病毒疫苗中的应用技术。本专利技术的目的通过以下方式实现：驯化成功一株适应全悬浮培养的PK15细胞株，命名为猪肾PK15-U悬浮细胞，保藏在中国典型保藏中心，保藏编号为CCTCCC201860，保藏日期为2018年03月21日。基于0006所述的猪肾PK15-U悬浮细胞在培养猪圆环病毒中的应用。基于0007所述的一种适应全悬浮培养的PK15细胞培养病毒的方法，包括如下步骤：①用悬浮培养瓶培养权利要求1所述猪肾PK15-U悬浮细胞至适当体积，以细胞密度为5-10×105个/ml接种至生物反应器中悬浮培养；②当猪肾PK15-U悬浮细胞密度达到1-3×106个/ml时，按照细胞培养基终体积1-10%接种病毒；③在生物反应器中继续培养猪肾PK15-U悬浮细胞至72-168h，收获病毒液。所述的生物反应器为工业化搅拌式生物反应器。相对于现有技术，本专利技术公开的适应全悬浮培养的PK15细胞株培养疫苗病毒自动化程度高，不需要载体介入，可以在无血清或低血清培养基中悬浮培养，解决病毒培养大规模产业化的要求，开发能满足GMP生产技术要求的大规模化生产方法，拥有很好的工业化应用前景。附图说明图1是PK15-U细胞悬浮培养生长曲线图。图2是PK15-U细胞悬浮培养形态图。具体实施方式以下是本专利技术具体的实施方案，以进一步阐述本专利技术，但不能解释为限制本专利技术的范围。本领域技术人应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本专利技术的保护范围内。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实验涉及的主要生物材料和设备。细胞：适应全悬浮培养的PK15细胞株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCC201860，保藏日期为2018年03月21日。细胞生长培养基：lifetechnologiesOptiPROTMSFM无血清培养基，添加2%胎牛血清，细胞生长培养基即是PK15细胞悬浮株摇瓶培养与生物反应器全悬浮培养所用的营养液。病毒：猪圆环病毒2型（PCV2）ZJ/C株，由杭州佑本动物疫苗有限公司提供。Corning125ml摇瓶；德国维根斯振荡器；三洋二氧化碳培养箱；Thermo二级生物安全柜。生物反应器：德国赛多利斯10L搅拌式生物反应器。实施例1：适应全悬浮培养的猪肾PK15-U悬浮细胞的培养①取生长良好的猪肾PK15-U悬浮细胞，加入盛有营养液的摇瓶中，于36-37℃培养48-72h，按照1:3到1:5的比例传代放大培养；②将步骤①中放大培养的猪肾PK15-U悬浮细胞稀释至（6-10）×105个/ml密度，接种入生物反应器，培养温度为36-37℃，pH值为6.8-7.2，溶氧为40%-60%，猪肾PK15-U悬浮细胞生长曲线如图1所示，悬浮培养时显微镜下的细胞形态见图2；③三批次生物反应器中细胞密度的测定：用生物反应器连续培养三个批次猪肾PK15-U悬浮细胞，培养条件同步骤②，在培养的第72小时采样，用台盼蓝染色法检测细胞密度，实验结果如表1所示。表1三批次生物反应器中细胞密度的测定结果。实施例2利用猪肾PK15-U悬浮细胞培养猪圆环病毒的方法取生长良好的猪肾PK15-U悬浮细胞，按6.5×105个/ml密度，接种入生物反应器，细胞培养条件为：反应器工作体积7.0升，细胞培养温度为37℃，pH值为7.0，溶氧为40%，培养20小时，细胞密度为11×105个/ml时，按照细胞培养液体积的8%接种猪圆环病毒，病毒培养条件为：温度36℃，pH值为7.0，溶氧为40%，培养144小时收获病毒液，病毒滴度按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》标准进行判定，收获病毒含量为7.0TCID50/ml。以上所述的仅是本专利技术的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本专利技术整体构思前提下，还可以做出若干改变和改进，这些也应该视为本专利技术的保护范围。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株适应全悬浮培养的PK15细胞，命名为猪肾PK15‑U悬浮细胞，已于2018年03月21日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201860。
【技术特征摘要】
1.一株适应全悬浮培养的PK15细胞，命名为猪肾PK15-U悬浮细胞，已于2018年03月21日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCC201860。2.根据权利1所述的适应全悬浮培养的猪肾PK15-U悬浮细胞在培养猪圆环疫苗病毒中的应用。3.一种PK15细胞株培养疫苗病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：①将权利要求1所述的猪肾PK15-U悬浮细胞用摇瓶悬浮培养扩增到一定体积后，以细胞密...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨桂花，董鹏，卫广森，吴孟晨，赵九娥，马凤龙，杨严格，
申请(专利权)人：金河佑本生物制品有限公司，金河牧星生物技术研究北京有限公司，杭州佑本动物疫苗有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15
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