一种犬瘟热病毒和犬细小病毒的二联亚单位疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种犬瘟热病毒和犬细小病毒的二联亚单位疫苗及其制备方法和应用。本发明专利技术创新地实现了一次表达纯化过程即可同时生产两种病毒亚单位疫苗的方法，纯化过程简单，生产用酶可回收再利用，降低生产成本。本发明专利技术所述二联亚单位疫苗中二聚体形式的犬瘟热病毒H蛋白和VLPs形式的犬细小病毒VP2蛋白的摩尔比为1：1，提高疫苗抗原纯度，免疫原性更强，成本更低。成本更低。成本更低。

【技术实现步骤摘要】
一种犬瘟热病毒和犬细小病毒的二联亚单位疫苗及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种犬瘟热病毒和犬细小病毒的二联亚单位疫苗及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]犬瘟热(Canine distemper)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)引起，感染犬科、鼬科和一部分浣熊科动物的高度接触性、致死性传染病。其可引发双相热型、急性卡他性呼吸道炎，胃肠炎和脑炎。CDV属于副粘病毒科，麻疹病毒属，为单股负链不分节段的RNA病毒，其基因组编码6个结构蛋白(依次为N、P、M、F、H、L)和2个非结构蛋白(C和V)。其中，H基因全长为1947nt，仅含有一个开放型阅读框，其编码的H蛋白是II型跨膜糖蛋白。成熟病毒粒子的H蛋白是由二硫键连接的同源二聚体，镶嵌在病毒囊膜表面，可与靶细胞表面的受体(如SLAM和nectin
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4)相互作用，介导病毒入侵宿主。H蛋白存在着许多中和性抗原表位，是诱导机体产生中和抗体的主要抗原。
[0003]犬细小病毒病是一种由细小病毒科细小病毒属的犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)引起的高致死性急性传染病。该病一年四季均可发生，具有发病急、病程短、死亡率高、传染性强等特点，是危害我国养犬业最严重的传染病之一。VP2蛋白是犬细小病毒衣壳蛋白的主要成分，能在体外自我组装形成类病毒样颗粒，该蛋白包含了病毒的中和表位，具有较强的免疫原性，是疫苗研发的主要靶抗原。
[0004]现有技术也存在有关于犬瘟热、犬细小病毒病二联亚单位疫苗的相关研究，如CN114317459A提供了一种犬瘟热病毒株和基于犬瘟热病毒和犬细小病毒的二联疫苗及应用，涉及犬瘟热病毒培养和杆状病毒表达犬细小病毒VP2两种生产工艺，生产过程繁杂，成本高。CN201810463652.7涉及一种犬瘟热细小病毒二联亚单位疫苗，采用犬瘟热病毒和犬细小病毒分别表达定量后混合的方法，抗原未经纯化，两次表达成本高于本技术。另外，现有的犬瘟热、犬细小病毒病二联亚单位疫苗还存在使用两个蛋白的病毒同时感染昆虫细胞，致使表达各蛋白的病毒的感染效率不同，蛋白产量不可控。细胞被多个杆状病毒感染时会发生高频重组，从而导致有缺陷的病毒产生而无法表达预期的多蛋白产物。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种犬瘟热病毒和犬细小病毒的二联亚单位疫苗及其制备方法和应用，该方法创新的实现了一次表达纯化过程即可同时生产两种病毒亚单位疫苗的方法，且纯化填料和酶切用酶均可重复使用，纯化过程简单，生产成本低。本专利技术所述二联亚单位疫苗中犬瘟热病毒和犬细小病毒的摩尔比为1：1，疫苗抗原纯度高，免疫原性更强，成本更低。
[0006]本专利技术提供了一种犬瘟热病毒和犬细小病毒的二联亚单位疫苗，所述二联亚单位疫苗包括CHO
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VP2；编码所述CHO
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VP2的基因为重组CHO
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VP2基因，所述重组CHO
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VP2基因包括编码Mouse IgG kappa信号肽的核苷酸序列、CDV H基因、犬IgG FC、TEV酶切基序和CPV VP2基因。
[0007]优选的，所述CHO
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VP2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0008]优选的，所述重组CHO
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VP2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0009]优选的，所述编码Mouse IgG kappa信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CDV H基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述犬IgG FC的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述TEV酶切基序的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述CPV VP2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0010]本专利技术还提供了一种犬瘟热病毒和犬细小病毒的二联亚单位疫苗的制备方法，包括如下步骤：将包括上述技术方案中所述的重组CHO
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VP2基因的重组表达载体转染细胞，获得细胞表达上清液；
[0011]将所述细胞表达上清液纯化获得纯化的目的蛋白；
[0012]将所述纯化的目的蛋白进行酶切获得酶切蛋白；
[0013]将所述酶切蛋白进行病毒样颗粒自组装后与佐剂混合，得到所述二联亚单位疫苗。
[0014]优选的，将所述纯化的目的蛋白进行酶切时使用的蛋白酶为TEV蛋白酶。
[0015]优选的，用于制备所述重组表达载体的载体包括质粒、病毒载体、黏粒或噬菌体。
[0016]优选的，所述转染细胞包括CHO细胞。
[0017]优选的，所述CHO细胞包括CHO
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K1细胞。
[0018]有益效果：
[0019]本专利技术提供了一种犬瘟热病毒和犬细小病毒的二联亚单位疫苗，所述二联亚单位疫苗包括CHO
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VP2，所述CHO
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VP2中包括截短的犬瘟热病毒H蛋白，删除与二聚体形成无关的N端1～147位氨基酸，包括胞内区、跨膜区和DUF4217结构域，形成同源二聚体蛋白；同时，在二联亚单位疫苗中加入FC标签，促进截短的犬瘟热病毒H蛋白形成二聚体，延长蛋白的半衰期，促进抗原递呈，便于下游纯化；
[0020]同时，通过在所述CHO
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VP2中加入TEV蛋白酶酶切基序，经TEV蛋白酶酶切产生的犬细小病毒VP2蛋白，最接近天然病毒序列，仅在N端多一个甘氨酸，不影响VLPs的形成。
[0021]再者，本专利技术所述二联亚单位疫苗中包括二聚体形式的犬瘟热病毒H蛋白和VLPs形式的犬细小病毒VP2蛋白，一次表达纯化过程，得到包括两种病毒的亚单位疫苗，保证二联亚单位疫苗中犬瘟热病毒和犬细小病毒的摩尔比为1：1，免疫原性更强，成本更低。
[0022]本专利技术还提供了一种犬瘟热病毒和犬细小病毒的二联亚单位疫苗的制备方法，所述制备方法中采用商品化proteinA填料纯化蛋白，且纯化填料和酶切用酶均可重复使用，纯化过程简单，不需要蛋白复性、离子交换层析等复杂工艺。同时，制备过程中采用的蛋白酶可回收，重复用于下次生产，节约成本。
附图说明
[0023]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0024]图1为本专利技术中犬瘟热病毒H蛋白的3D结构预测图；
[0025]图2为pEE12.4载体图谱。
具体实施方式
[0026]本专利技术提供了一种犬瘟热病毒和犬细小病毒的二联亚单位疫苗，所述二联亚单位疫苗包括CHO
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种犬瘟热病毒和犬细小病毒的二联亚单位疫苗，其特征在于，所述二联亚单位疫苗包括CHO
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VP2；编码所述CHO
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VP2的基因为重组CHO
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VP2基因，所述重组CHO
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VP2基因包括编码Mouse IgG kappa信号肽的核苷酸序列、CDV H基因、犬IgG FC、TEV酶切基序和CPVVP2基因。2.根据权利要求1所述的二联亚单位疫苗，其特征在于，所述CHO
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VP2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。3.根据权利要求1或2所述的二联亚单位疫苗，其特征在于，所述重组CHO
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VP2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。4.根据权利要求3所述的二联亚单位疫苗，其特征在于，所述编码Mouse IgG kappa信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CDV ...

【专利技术属性】
技术研发人员：李雪峰，康斌，郭海军，武玉梅，董鹏，张金龙，赵炳武，王家福，
申请(专利权)人：金河佑本生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：