鲑科鱼类传染性胰腺坏死病重组腺病毒疫苗的加工方法技术

本发明专利技术提供了一种鲑科鱼类传染性胰腺坏死病重组腺病毒疫苗的加工方法，包括扩增传染性胰腺坏死病病毒VP2基因、VP3基因以及口蹄疫病毒2A肽基因，构建带有目的基因的PAd

【技术实现步骤摘要】
衣壳蛋白作为免疫原性区域的疫苗，他们测试了该DNA疫苗采用脂质体包裹后用于拌料 饲喂是否达到免疫效果，当受到IPNV的感染时，单剂量饲喂组的相对生存百分比(Relativepercentage survival,RPS)为58.2％，双剂量饲喂组的RPS为66％。此外，郭梦婷等人以 rIHNV
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HLJ
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09作为载体，将NV基因替换为IPNV的VP2或VP2
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COE基因，构建了两 种重组病毒，该重组病毒对IHNV和IPNV具有良好的保护率，RPS约为65％，但该疫苗 仍需要进一步改进以提供更高的保护效果。Ballesteros等人通过将IPNV的VP2基因插 入到一种表达质粒并将其封装到藻酸盐微球中，研制出一种口服IPNV DNA疫苗，口服 该DNA疫苗后的RPS约为83％。Dalar等人将IPNVVP2
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VP3融合基因克隆到大肠杆菌 表达载体(pET
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26b)中，并将其制作成IPNV的重组疫苗，腹膜内注射该重组疫苗后， 接种疫苗组的相对生存百分比(RPS)为83％，但通过注射途径免疫鲑鱼本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鲑科鱼类传染性胰腺坏死病重组腺病毒疫苗的加工方法，其特征在于，包括如下步骤：扩增传染性胰腺坏死病病毒VP2基因、VP3基因以及口蹄疫病毒2A肽基因后，将其连接到PAd
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Track
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CMV载体，PCR筛选阳性后与PAd
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easy
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1骨架载体同源重组，构建出复制缺陷型重组腺病毒质粒，利用该质粒转染细胞后获得含有目的基因的复制缺陷型重组腺病毒；将检测后阳性重组腺病毒接种于293细胞进行多次传代，选择高滴度重组腺病毒制备成鲑科鱼类传染性胰腺坏死病重组腺病毒疫苗，其中，扩增VP2基因和VP3基因的引物中分别添加有PAd
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Track
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CMV载体同源臂序列和不同的酶切位点，扩增口蹄疫病毒2A肽基因的引物中添加有VP2和VP3基因同源臂。2.根据权利要求1所述的鲑科鱼类传染性胰腺坏死病重组腺病毒疫苗的加工方法，其特征在于：其中，VP2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，VP3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，口蹄疫病毒2A肽基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；用于扩增VP2基因的引物序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；用于扩增VP3基因的引物序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；用于扩增口蹄疫病毒2A肽基因的引物序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；PCR筛选所用的引物序列分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。3.根据权利要求1所述的鲑科鱼类传染性胰腺坏死病重组腺病毒疫苗的加工方法，其特征在于，所述加工方法具体包括如下步骤：(1)目的基因克隆：分别以合成的IPNV基因和口蹄疫病毒2A肽基因为模板，采用PCR方法进行扩增，得到IPNV VP2、IPNV VP3及F2A基因，其中，扩增VP2基因和VP3基因的引物中分别添加有PAd
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Track
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CMV载体同源臂序列和不同的酶切位点，扩增口蹄疫病毒2A肽基因的引物中添加有VP2和VP3基因同源臂；(2)构建带有目的基因的PAd
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Track
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CMV载体：将克隆得到的IPNV VP2、IPNV VP3及F2A基因，通过多基因片段同源重组技术克隆到PAd
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Track
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CMV载体，构建出带有IPNV VP2、IPNV VP3及F2A基因的PAd
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Track
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CMV载体，命名为PAd
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Track
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CMV/VP2
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F2A
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VP3；(3)获得重组腺病毒质粒：将获得的重组腺病毒载体PAd
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Track
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CMV/VP2
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F2A
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VP3与PAd
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easy
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1载体在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，构建出重组腺病毒质粒；(4)筛选获得重组腺病毒：将筛选得到的重组腺病毒阳性质粒经PacⅠ酶切后用于转染293细胞，获得带有目的基因的重组腺病毒；(5)制备出传染性胰腺坏死病重组腺病毒疫苗：将步骤4中收获的重组腺病毒传代后，对目的抗原蛋白的表达进行检测，将检测后蛋白能够表达的重组腺病毒接种于293细胞进行多次传代、反复冻融并测定病毒滴度，用高滴度的重组腺病毒制备出鲑科鱼类传染性胰腺坏死病重组腺病毒疫苗。4.根据权利要求2所述的鲑科鱼类传染性胰腺坏死病重组腺病毒疫苗的加工方法，其特征在于：
其中，步骤(1)中，IPNV VP2基因的正向引物中增加了PAd
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Track
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CMV载体同源臂和NotⅠ酶切位点，序列如SEQ ID NO.4所示；反向引物中增加了PAd
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CMV载体同源臂和NotⅠ酶切位点，引物序列如SEQ ID NO.5所示；IPNV VP3基因的正向引物中增加了PAd
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CMV载体同源臂和HindⅢ酶切位点，序列如SEQ ID NO.6所示；反向引物中增加了PAd
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CMV载体同源臂和HindⅢ酶切位点，引物序列如SEQ ID NO.7所示；F2A基因的正向引物中增加了IPNV VP3基因同源臂，反向引物中增加了IPNV VP2基因同源臂，正向引物和反向引物序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。5.根据权利要求2所述的鲑科鱼类传染性胰腺坏死病重组腺病毒疫苗的加工方法，其特征在于：其中，步骤(2)中带有目的基因PAd
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CMV载体的构建方法如下：1)将腺病毒PAd
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CMV载体经HindⅢ和NotⅠ酶切后得到线性化的载体；2)将VP2基因PCR产物、6倍质量的F2A基因PCR产物、相同质量的VP...

【专利技术属性】
技术研发人员：石建高，李守湖，李新苍，陈寿旭，杨清风，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院东海水产研究所，
类型：发明
国别省市：