一种登革四价DNA疫苗及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种登革四价DNA疫苗及其应用，属于登革疫苗技术领域。本发明专利技术提供的登革四价DNA疫苗的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术提供的登革四价DNA疫苗是针对四种血清型DENV的DNA疫苗。在野生型BALB/c小鼠中接种了针对4种血清型DENV的DNA疫苗后可产生针对4种血清型登革病毒的特异性IgG抗体，并且诱导出具有保护效应的中和抗体和抗病毒特异性T细胞免疫。胞免疫。胞免疫。

【技术实现步骤摘要】
一种登革四价DNA疫苗及其应用


[0001]本专利技术涉及登革疫苗
，尤其涉及一种登革四价DNA疫苗及其应用。

技术介绍

[0002]登革病毒(DENV)的四种血清型是登革热和登革出血热的病原体，分为四个不同的血清型，即登革热血清型1至4型(DENV
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1至DENV
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4)。登革热病毒由伊蚊传播。蚊子以及病毒和媒介广泛分布于所有热带和亚热带地区，估计每年造成3亿新感染者，约100万例严重疾病，病死率为2～5％。值得注意的是，患者初次感染单一血清型的DENV后，可以诱导对同型DENV的长期免疫，但继发感染会导致严重疾病，特别是在异型感染之后。这一现象的确切原因尚不清楚，但抗体依赖增强(ADE)现象可能会导致致病性和毒力增加。当来自先前异型感染的抗体不能中和不同亚型的继发感染，但仍然与病毒蛋白结合时，就会发生ADE。这会产生一种病毒
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抗体复合体，由通常不通过Fcγ受体感染的细胞吞噬，特别是通过FcγIIa受体感染的单核细胞。这会导致病毒血症产生。虽然只有1％的DENV病例出现严重疾病，但严重病例的死亡率可高达20％。这对疫苗研发提出了挑战，因为一种成功的疫苗必须引起对所有四种血清型DENV平衡的中和、持久的免疫反应。
[0003]目前研究进展最大的DENV疫苗包括CYD
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TDV(赛诺菲
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巴斯德)、TAK
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003(DENV
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AX；武田)和TV
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003(NIAID/NIH)，这是三种减毒活疫苗，存在毒力回复风险，易引发ADE效应。并且近年来登革热临床试验的长期数据表明，赛诺菲
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巴斯德疫苗只对那些在接种疫苗前已被DENV感染的人有效。接种疫苗的未感染个体在接触登革热病毒后似乎面临更大的严重疾病风险，目前建议只在对登革热病毒有免疫力的人中使用该疫苗。截至目前，登革病毒疫苗在DNA疫苗领域的研发略为滞后，有实验团队研发出4种血清型登革病毒核酸疫苗，他们能激起小鼠体内产生较强针对某一两种血清型病毒的特异性体液、细胞免疫，但对另外几种血清型登革病毒的抗感染效果就较差，目前为止登革病毒核酸疫苗的研究仅停留在临床前阶段。
[0004]DENV基因组为11Kb的单股正链RNA，编码衣壳蛋白C，膜前体蛋白prM和包膜蛋白E三个结构蛋白和7个非结构蛋白域NS，结构蛋白E中的EDIII(envelope protein domain III)已被确定为高度中和和保护性的血清型特异性抗体的主要靶点。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种登革四价DNA疫苗及其应用。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种登革四价DNA疫苗，所述DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0008]优选的，所述疫苗为包含权利要求1所述的核苷酸序列的表达载体。
[0009]优选的，所述表达载体为PVAX1。
[0010]本专利技术还提供了一种所述的疫苗在免疫四种血清型登革病毒中的用途。
[0011]本专利技术提供的登革四价DNA疫苗，是针对四种血清型DENV的DNA疫苗。在野生型
BALB/c小鼠中接种针对4种血清型DENV的DNA疫苗后，可产生针对4种血清型登革病毒的特异性IgG抗体，并诱导出具有保护效应的中和抗体和抗病毒特异性T细胞免疫。
附图说明
[0012]图1为实施例1构建的含有SEQ ID NO：1所示基因序列的PVAX1
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ED3质粒。
[0013]图2为实施例2中DNA疫苗免疫小鼠诱导的体液免疫应答；结果以标准误表示(n＝5)，ns表示无显著差异，星号表示显著差异(t
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test，*，P<0.05；**，P<0.01)。
[0014]图3为实施例2中DNA疫苗免疫小鼠产生登革病毒特异性T细胞免疫应答；结果以标准误表示(n＝3)，星号表示显著差异(t
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test，*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。
[0015]图4为实施例3进行的DENV
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2的体内中和实验，(n＝5)；星号表示有显著性差异(*，P﹤0.05)。
具体实施方式
[0016]下面结合实施例对本专利技术提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本专利技术保护范围的限定。
[0017]实施例1
[0018]将如SEQ ID NO：1所示的基因序列交于上海金斯瑞公司构建至pCDNA3.1(+)载体上，得到pCDNA3.1
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EDIII。合成的pCDNA3.1
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EDIII，通过Nde I和SalI酶切后将片段构建至PVAX1表达载体上，得到质粒PVAX1
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ED3，如图1所示。
[0019]PVAX1
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ED3质粒经扩增培养后，使用增强型无内毒素质粒大提试剂盒(天根生化，DP120
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01)，按说明书步骤提取质粒，并纯化，在提取质粒柱纯化最后一步将质粒溶于RNase Free water中，配成浓度为600ng/μL的免疫用疫苗。
[0020]实施例2
[0021]6周龄雌性BALB/c小鼠(陆军军医大学动物中心，重庆)随机分为2组，每组5只，分别为实验组和对照组。实验组在第0、14和42天以电脉冲肌肉注射的方式给小鼠接种实施例1制备的疫苗。对照组在第0、14和42天以电脉冲肌肉注射的方式给小鼠接种空载体PVAX1。DNA疫苗每一剂量含有30μg的DNA，50μL；对照组每剂50μL，含空载质粒约30μg。
[0022]于第3次免疫后的一周(即第49天)，从小鼠尾静脉采集约100μL的血液，在4℃，10min,3000rpm下离心，分离血清。血清保存在
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80℃中，用与ELISA法分析；采血后，对小鼠进行眼球取血后断颈处死，取脾脏细胞进行ELISPOT分析。
[0023](1)ELISA法(酶联免疫吸附试验)测定小鼠血清总IgG
[0024]用包被缓冲液分别稀释四种血清型Dengue virus Envelope Protein
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Domain III(Sino Biolgical,40531
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V08B,40471
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V08Y1,40532
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V08H1,40533
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V08B2)抗原至5μg/mL，分别包被96孔板，100μL/孔，抗原包被量为0.5μg，在4℃过夜。PBST溶液洗板5次，以去除未包被上的抗原，每孔加入200μL封闭液(含5％BSA的PBST)，置于37℃孵育2h。封闭结束后弃封闭液，PBST溶液洗板3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种登革四价DNA疫苗，其特征在于，所述DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为包含权利要求1所述的核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晋涛，周伃欣，丁晓艳，全纹萱，何久香，华栋，柳敏驰，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学，
类型：发明
国别省市：