小鼠胎肝基质细胞构建方法及其在造血辅助中的应用技术

本发明专利技术公开了一种小鼠胎肝基质细胞构建方法及其在造血辅助中的应用。通过胎肝基质细胞获取及体外培养，骨髓LK细胞分离和细胞骨髓腔内移植的操作步骤完成。本发明专利技术制备的胎肝基质细胞在造血重建的早期能促进PLT和RBC的恢复，促进HSC的增殖和快速扩增，这对HSC移植中改善宿主的造血微环境，提升造血重建效率有重要意义。

Construction of mouse fetal hepatic stromal cells and its application in hematopoietic assistance

The invention discloses a method for constructing mouse fetal liver stromal cells and its application in hematopoietic assistance. Through fetal liver stromal cells acquisition and culture in vitro, the operation steps of bone marrow LK cells isolation and intramedullary transplantation were completed. The fetal liver stromal cells prepared by the invention can promote the recovery of PLT and RBC in the early stage of hematopoietic reconstruction, promote the proliferation and rapid expansion of HSC, which is of great significance for improving the host hematopoietic microenvironment and improving the hematopoietic reconstruction efficiency in HSC transplantation.

【技术实现步骤摘要】
小鼠胎肝基质细胞构建方法及其在造血辅助中的应用
本专利技术属于造血细胞构建
，具体涉及小鼠胎肝基质细胞构建方法及其在造血辅助中的应用。
技术介绍
基质细胞最早由FriedensteinA等从豚鼠BM中分离得到，与造血细胞不同，它们是一类可以在塑料材质器皿上贴壁生长的成纤维样细胞，后来这类细胞被发现能向成骨、软骨和脂肪细胞分化，因此基质细胞就慢慢被称为间充质干细胞(mesenchymalstemcell,MSC)，但由于对小鼠MSC的认定缺乏统一的标准，国内外不同研究者建立的MSC差异很大，这些差异主要体现在表面标志表达上。一般认为MSC不表达血系标志CD45，但也有研究者分离到CD45+的小鼠BMMSC。CD34作为一种造血细胞的标志同样被认为在MSC中不表达，但Peister等人从B1/6小鼠BM中分离得到的MSCCD34阳性率超过75％。CD44为透明质酸的受体，普遍认为在MSC中高表达，但仍有研究者培养得到的两类基质细胞都不表达CD44。Sca-1是小鼠HSC的标志，其在MSC中的表达率也存在争议，不同研究差别较大，PostS等人得到的BMMSCSca-1阳性率高达90％，而在张荣耀等人的研究中只有32％，Saeed等人分离得到的BMMSC，Sca-1阳性率则介于60％-90％之间。需要指出的是，MSC高表达整联蛋白CD29，不表达淋巴细胞标志CD11b，目前仍是公认的观点。表达不同表面标志的MSC常常具有不同的形态，惠大阳等人培养获得了近圆形、成纤维细胞形和纺锤多边形三种类型的BMMSC，其中近圆形细胞CD90表达率为16％，另两种类型的细胞则为90％左右；苑春慧等人分离得到的上皮形FLMSCCD105阳性率为97％，而成纤维形细胞仅为14％。造血干细胞(hematopoieticstemcell,HSC)作为目前临床应用最为广泛的成体干细胞，被用于治疗各类急慢性白血病、淋巴瘤、再生障碍性贫血、地中海贫血、重症联合免疫缺陷等血液和免疫系统疾病，但是由于来源于外周血(peripheralblood,PB)、骨髓(bonemarrow，BM)和脐带血的HSC资源稀缺，导致了大量病人无法及时进行HSC移植，因此如何在体外获得大量的HSC成为了相关领域的研究热点。哺乳动物胎肝(fetalliver,FL)造血时期是HSC成熟和快速扩增的时期，FL中除了血系细胞外，还有各类能在体外贴壁生长的非血系细胞，他们被统称为基质细胞，由FL基质细胞构成的造血微环境对HSC的扩增起到了重要的辅助作用。目前国内外的研究集中于将FL基质细胞作为饲养层细胞，诱导其他类型的细胞分化为HSC并大量扩增，但在目前的研究中，鲜有科研人员探索FL基质细胞在体内发挥的造血辅助作用：其在体内环境下的造血辅助作用是否与体外有所差异，能否促进外源HSC在受体体内的归龛、增殖和分化等问题仍有待探索。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种小鼠胎肝基质细胞构建方法及其在造血辅助中的应用。一种小鼠胎肝基质细胞构建方法，按照如下步骤进行：(1)胎肝基质细胞获取及体外培养颈椎脱臼处死孕鼠，无菌条件下取出胎肝并吹打为细胞悬液，过25-35μm滤网制备单细胞悬液，用淋巴细胞分离液分离胎肝单个核细胞，按照0.5*106-2*106/cm2的密度接种于培养皿中的培养液上，置于37℃，5％CO2浓度培养箱中培养，接种20-28h后初次换液，此后每2-3天换液，当细胞汇聚程度达78-82％时按照1:2传代培养；(2)骨髓LK细胞分离将雌鼠经颈椎脱臼处死，无菌条件下取出胫骨及股骨，冲出骨髓细胞，过25-35μm滤网制备单细胞悬液，再用淋巴细胞分离液分离得到骨髓单个核细胞，此后按照磁珠分选试剂盒操作流程分离出Lin-c-Kit+细胞，细胞计数后置于4℃备用；(3)细胞骨髓腔内移植取1％戊巴比妥钠溶液麻醉小鼠后剪开膝关节处皮肤，用0.5-2mL注射器从开口处刺入胫骨骨髓腔，拔出针头，再用20-30μL进样器吸取细胞悬液从刚刚的针孔处插入骨髓腔并注入细胞，注射骨髓LK细胞和胎肝基质细胞，培养6-12周。所述培养皿中的培养液为高糖DMEM，15％胎牛血清(v/v)，1％青/链霉素(v/v)和0.1mMβ-巯基乙醇。优选的，步骤(3)所述骨髓LK细胞的注射量为1.7*104个，胎肝基质细胞的注射量为2.3*105个。优选的，步骤(1)和步骤(2)所述滤网孔径大小为30μm。优选的，步骤(3)所述注射器为1mL注射器，进样器为25μL进样器。上述制备的小鼠胎肝基质细胞在造血辅助中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术制备的胎肝基质细胞在造血重建的早期能促进PLT和RBC的恢复，促进HSC的增殖和快速扩增，这对HSC移植中改善宿主的造血微环境，提升造血重建效率有重要意义。附图说明图1为基质细胞形态及表面标志表达；图中，A：FL基质细胞；B:BM基质细胞；bar：100μm。图2为受体生存率及各项血液指标变化；图中，A：生存率；B：PB各项血液指标；C：移植后前两周PLT、RBC和HGB含量；p<0.05表示有统计学意义。图3为受体外周血和骨髓外源血系细胞嵌合率及染色(800X)；图中，A：受体嵌合率；B：瑞氏-吉姆萨染色。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术做进一步说明。下述实施例采用的实验动物及主要试剂如下：FL基质细胞来源于C57BL/6CD45.2/CD45.2雌鼠与雄鼠交配后怀孕13.5天(E13.5)的胎鼠，BM基质细胞来源及细胞移植受体小鼠为C57BL/6CD45.2/CD45.2雌鼠；BMLK细胞来源于C57BL/6CD45.1/CD45.2雌鼠。小鼠购置于上海灵畅生物科技有限公司[生产许可：SCXK(沪)2013-0018]和上海南方模式生物科技股份有限公司[生产许可：SCXK(沪)2017-0010]。淋巴细胞分离液(Stemcell)；Lin-c-Kit+细胞磁珠分选试剂盒(Miltenyi)；CD44、CD29、CD45.1、CD45.2及Sca-1抗体均购置于BDPhamingen公司。实施例1基质细胞获取及体外培养，表面标志表达检测颈椎脱臼处死孕鼠，无菌条件下取出FL并吹打为细胞悬液，过30μm滤网制备单细胞悬液，用淋巴细胞分离液分离FL单个核细胞，按照0.5*106-2*106/cm2的密度接种于培养皿上，培养液为高糖DMEM+15％胎牛血清(v/v)+1％青/链霉素(v/v)+0.1mMβ-巯基乙醇，置于37℃，5％CO2浓度培养箱中培养。接种24h后初次换液，此后每2-3天换液，当细胞汇聚程度达80％左右时按照1:2传代培养。BM基质细胞取自小鼠胫骨及股骨，除了培养液为低糖DMEM外，其余培养方式同FL基质细胞。取培养1-4代的FL及BM基质细胞，用0.25％的胰酶溶液消化细胞，然后用磷酸缓冲液(phosphatebufferedsaline,PBS)洗一次，加入CD44、CD29及Sca-1抗体4℃避光孵育25min，PBS洗两次后用流式细胞仪(Beckman,CytoFlex)分析。原代细胞接种24h后，在显微镜下即可看见有贴壁的基质细胞出现，原代培养的基质细胞形态多为近圆形，短梭形和成纤维细胞形，另有一些不规则的有突起本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小鼠胎肝基质细胞构建方法，其特征在于，按照如下步骤进行：(1)胎肝基质细胞获取及体外培养颈椎脱臼处死孕鼠，无菌条件下取出胎肝并吹打为细胞悬液，过25‑35μm滤网制备单细胞悬液，用淋巴细胞分离液分离胎肝单个核细胞，按照0.5*106‑2*106/cm2的密度接种于培养皿中的培养液上，置于37℃，5％CO2浓度培养箱中培养，接种20‑28h后初次换液，此后每2‑3天换液，当细胞汇聚程度达78‑82％时按照1:2传代培养。(2)骨髓LK细胞分离将雌鼠经颈椎脱臼处死，无菌条件下取出胫骨及股骨，冲出骨髓细胞，过25‑35μm滤网制备单细胞悬液，再用淋巴细胞分离液分离得到骨髓单个核细胞，此后按照磁珠分选试剂盒操作流程分离出Lin‑c‑Kit+细胞，细胞计数后置于4℃备用；(3)细胞骨髓腔内移植取1％戊巴比妥钠溶液麻醉小鼠后剪开膝关节处皮肤，用0.5‑2mL注射器从开口处刺入胫骨骨髓腔，拔出针头，再用20‑30μL进样器吸取细胞悬液从刚刚的针孔处插入骨髓腔并注入细胞，注射骨髓LK细胞和胎肝基质细胞，培养6‑12周。

【技术特征摘要】
1.一种小鼠胎肝基质细胞构建方法，其特征在于，按照如下步骤进行：(1)胎肝基质细胞获取及体外培养颈椎脱臼处死孕鼠，无菌条件下取出胎肝并吹打为细胞悬液，过25-35μm滤网制备单细胞悬液，用淋巴细胞分离液分离胎肝单个核细胞，按照0.5*106-2*106/cm2的密度接种于培养皿中的培养液上，置于37℃，5％CO2浓度培养箱中培养，接种20-28h后初次换液，此后每2-3天换液，当细胞汇聚程度达78-82％时按照1:2传代培养。(2)骨髓LK细胞分离将雌鼠经颈椎脱臼处死，无菌条件下取出胫骨及股骨，冲出骨髓细胞，过25-35μm滤网制备单细胞悬液，再用淋巴细胞分离液分离得到骨髓单个核细胞，此后按照磁珠分选试剂盒操作流程分离出Lin-c-Kit+细胞，细胞计数后置于4℃备用；(3)细胞骨髓腔内移植取1％戊巴比妥钠溶液麻醉小鼠后剪开膝关节处皮肤，用0.5-2mL注射器...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾凡一，黄淑帧，薛燕，王沄汉，
申请(专利权)人：上海市儿童医院，上海滔华生物医药科技合伙企业有限合伙，
类型：发明
国别省市：上海,31