用于特异性检测结核分枝杆菌感染的蛋白Rv2824c制造技术

本发明专利技术公开了用于特异性检测结核分枝杆菌感染的蛋白Rv2824c。本发明专利技术提供了Rv2824c蛋白在制备检测或辅助检测结核分枝杆菌产品中的应用；所述Rv2824c是如下a)或b)的蛋白：a)序列表中的序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中的序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列1所示蛋白具有相同功能的由a)衍生的蛋白质。本发明专利技术的实验证明，能够更有效的提高结核分支杆菌感染检出率。

【技术实现步骤摘要】
用于特异性检测结核分枝杆菌感染的蛋白Rv2824c
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及用于特异性检测结核分枝杆菌感染的蛋白Rv2824c。
技术介绍
多个世纪以来，结核病持续在全球成为一个不容忽视的公共卫生问题。目前全球已有三分之一的人口携带结核分枝杆菌，仅2010年一年就新增结核病病例880万，死亡145万，平均不到22秒即有一人死于肺结核病，结核病高居传染病死亡人数之首。科学证明表明由于活动性肺结核的极易传播性，对活动性肺结核的诊断及尽快消除传染源，控制结核病流行有非常重大的意义。然而肺结核的根治目前还不能完全做到，据研究表明活动性结核病患者经不同的短程化疗治愈后，有1％-9％的患者将会复发，而在一些特殊人群中，高达20％(HongKongChestService/BritishMedicalResearchCouncil.AmRevRespirDis,1991,143:700-706)，而且耐药性结核病进一步传播与复发未及时诊断的结核患者有很大的关系。所以关于结核治愈患者的活动性肺结核诊断对于防治结核的整体战略具有很大的意义。目前活动性判断应综合临床、X线表现和痰菌决定，而主要依据是痰菌和X线。痰涂片检查简便易行，准确性较高，是活动性肺结核确诊的金标准，但某些研究中其检出率甚至低于10％。基于核酸扩增的诊断方法，如实时定量PCR以及DNA芯片的优点是灵敏度高且耗时短，其问题在于特异性较难保证，容易导致假阳性结果。而基于抗原抗体反应的血清学诊断，由于其简便性、快速性，日益成为重要的活动性肺结核临床辅助性诊断手段，并且能满足区分结核康复人群与活动性肺结核的要求。因此，从长远角度综合来看，应致力于发现敏感性和特异性均较好的结核标志物。理想的结核诊断标志物应符合以下条件：(1)敏感性高；(2)特异性高；(3)存在于体液，特别是血液中，易于检测。但是目前肺结核分支杆菌血清学诊断所针对的抗原如抗原5、38KD抗原、30/31KD抗原以及抗原60等，均存在阳性检出率低，与其它分支杆菌的交叉免疫性等问题，虽然在疗效监测、提示复发、判断预后和高危人群的普查中具有一定的价值，但目前仍不能用于活动性肺结核的确诊。为了实现对活动性肺结核的高灵敏性，高特异性的诊断，急需在分子水平上寻找到更敏感、更特异的活动性肺结核生物标志物。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供Rv2824c蛋白的用途。本专利技术提供Rv2824c蛋白在制备检测或辅助检测结核分枝杆菌产品中的应用；所述Rv2824c是如下a)或b)的蛋白：a)序列表中的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中的序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列2所示蛋白具有相同功能的由a)衍生的蛋白质。Rv2824c是已知的蛋白，根据个体差异，该蛋白可能有不同的序列，它们可能存在一个或几个氨基酸的差异，但是都在本专利技术的范围内，本专利技术的一个实施例中使用的蛋白的序列是序列2。上述Rv2824c蛋白在制备检测或辅助检测待测患者是否感染结核分枝杆菌产品中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术的另一个目的是提供一种检测或辅助检测待测样本是否感染结核分枝杆菌的产品。本专利技术提供的产品，包括Rv2824c蛋白。上述产品还包括阳性质控和阴性对照孔；所述阳性质控为植物血凝素PHA；所述阴性对照孔为无抗原的细胞培养液。上述产品中，所述产品还包括记载如下内容的可读载体(可为说明书)：若检测结果满足如下条件：阴性对照孔斑点数为0-5,且Rv2824c检测孔斑点数-阴性对照孔斑点数≥6；或若阴性对照孔斑点数大于等于6,且(Rv2824c检测孔斑点数-阴性对照孔斑点数)≥2×(阴性对照孔斑点数)；则待测样本候选感染结核分枝杆菌，为阳性样本；若检测结果满足如下所述条件，则待测样本候选未感染结核分枝杆菌；所述阴性对照孔为阴性对照所在孔，所述Rv2824c检测孔为所述Rv2824c蛋白所在孔。上述产品为试剂盒，上述试剂盒具体为T-SPOT试剂盒，也可以为ELISA试剂盒。上述T-SPOT试剂盒还包括T-SPOT试剂盒中的微孔培养板、浓缩标记抗体、显色底物溶液。上述试剂盒为Oxfordimmunotec(英国)的产品。本专利技术第三个目的是提供一种用于鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查结核分枝杆菌的标志物。本专利技术提供的标志物，为Rv2824c蛋白。本专利技术的实验证明，本专利技术筛选了结核分枝杆菌来源的蛋白片段，提供了一种检测结核病的结核分枝杆菌标识物抗原RV2824c，通过该抗原来体外检测特异性T细胞免疫反应，可以作为诊断结核病患者的参照，用于诊断患者是否被结核分枝杆菌感染。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。部分试剂如下：lysisbuffer：20mMTris-HCl、500mM氯化钠、10％甘油、pH8.0Washbuffer：20mMTris-HCl、20mM咪唑、500mM氯化钠、10％甘油、pH8.0Elutionbuffer：20mMTris-HCl、250mM咪唑、500mM氯化钠、10％甘油、pH8.0层析缓冲液：取磷酸二氢钾13.609g(配制1000ml)，加0.1mol/l氢氧化钠溶液，调节pH至7.5，得到pH值为7.5的PBS缓冲液。固化Ni+层析树脂Novagen，Ni-NTAHis，(Cat.NO70691-5，北京华美；2-8度保存)；蛋白结合能力大于5mg/mlresin层析柱(玻璃或者聚丙烯)。superdex75：(GE)。包涵体缓冲液：50mMtris，0.05MEDTA；包涵体洗涤液：50mMtris，0.05MEDTA，2％DOC，1M尿素；包涵体溶解液：50mMTris-HCl，8M尿素；下述实施例采用结核感染T细胞检测试剂盒是Oxfordimmunotec(英国)的T-SPOT试剂盒，为ESAT-6和CFP10双抗原试剂盒。实施例1、原核表达目的蛋白Rv2824c目的蛋白Rv2824c的制备：将表达Rv2824c蛋白编码基因的重组载体pET28a-Rv2824c导入大肠杆菌BL21中，得到重组菌BL21/pET28a-Rv2824c；再IPTG诱导重组菌BL21/pET28a-Rv2824c，收集上清液，即为目的蛋白Rv2824c。具体如下：1、表达目的蛋白重组菌的构建Rv2824c蛋白的氨基酸序列为序列2，其编码基因的核苷酸序列为序列1。将序列1所示的Rv2824c蛋白编码基因插入pET28a载体的NdeI和EcoRI位点，得到重组载体pET28a-Rv2824c；将重组载体导入大肠杆菌BL21中，得到重组菌BL21/pET28a-Rv2824c。2、蛋白表达1)重组菌BL21/pET28a-Rv2824c在37℃静置过夜(16h左右)。2)接种于5ml液体LB培养基(加入5ulkan)，200rpm，37℃过夜培养，12h左右。3)将过夜培养的菌液按接种量150-200ul接种于已加入相应抗性的200mlLB液体培养基中，在37℃，200rpm条件下培养至菌液OD600为0.6-0.8；4)加入终浓度0.4mMIPTG开始本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.Rv2824c蛋白在制备检测或辅助检测结核分枝杆菌产品中的应用；所述Rv2824c是如下a)或b)的蛋白：a)序列表中的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中的序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列2所示蛋白具有相同功能的由a)衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.Rv2824c蛋白在制备检测或辅助检测结核分枝杆菌产品中的应用；所述Rv2824c是如下a)或b)的蛋白：a)序列表中的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中的序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列2所示蛋白具有相同功能的由a)衍生的蛋白质。2.Rv2824c蛋白在制备检测或辅助检测待测患者是否感染结核分枝杆菌产品中的应用。3.一种检测或辅助检测待测样本是否感染结核分枝杆菌的产品，包括Rv2824c蛋白。4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于：所述产品还包括阳性质控和阴性对照孔；所述阳性质控为植物血凝素PHA；所述阴性对照孔为无抗原的细胞培养液。5.根据权利要求3或4...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕利军，张先恩，朱国峰，陶生策，邓教宇，张泓泰，侯剑，王雅果，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，广东体必康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11