牛病毒性腹泻病毒抗原胶体金检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种具有高灵敏度和特异性的牛病毒性腹泻病毒抗原胶体金检测试剂盒，其主要由BVDV抗原胶体金检测试纸条、包被有冻干的胶体金标记P80特异性单克隆抗体的微孔试剂、酶标板架、样本稀释液等组成。本发明专利技术提供的检测试剂盒无需昂贵设备，操作简便，无需特殊培训，检测灵敏度高，非常适合基层实验室、现场检测等领域广泛应用。

【技术实现步骤摘要】
牛病毒性腹泻病毒抗原胶体金检测试剂盒及其应用
本专利技术属于动物疫病诊断检测领域，涉及一种牛病毒性腹泻病毒抗原胶体金检测试剂盒及其在牛病毒性腹泻检测中的应用。
技术介绍
牛病毒性腹泻（BovineViralDiarrhea，BVD）是由牛病毒性腹泻病毒（BovineViralDiarrheaVirus，BVDV）所引起的病毒性传染病。各种年龄的牛群都易感染，其中犊牛易感性最高。传染源主要是病牛，其分泌物、排泄物、血液和脾脏等都含有病毒，以直接接触或间接接触方式传播。BVD自然感染的潜伏期为7~10天，短者为2天，长者为14天。临床上表现形式有慢性感染、急性感染及持续感染等。其中持续感染（PersistantInfection，PI）是母牛妊娠早期BVDV病毒经胎盘垂直感染胎儿造成的。多数PI牛表现为早产、生长缓慢、发育不良及饲养困难等，部分个体抵抗力差，并在出生后六个月内死亡，母源抗体不能改变犊牛的病毒血症状态。PI牛最大的危害是持续排毒，它是BVDV在自然界维持存在的一种形式。鉴于BVDV病毒的持续感染特性，目前兽医临床上并无有效防御办法，国内外主要采取持续淘汰和疫苗免疫等方法进行本病的防控。BVDV病毒属于黄病毒科的瘟病毒属，是单链RNA病毒，长度为12.3kb~12.5kb，编码8种非结构蛋白p20、p7、p125、p10、p30、p58和p75。其中p125蛋白在致细胞病变（CP）型BVDV病毒结构中呈NS3（p80）形式存在。p80蛋白大约由680个氨基酸残基组成，分子量约为80kDa，在瘟病毒属中非常保守，是免疫优势蛋白。特别是P80蛋白本身在病毒基因中存在，并不表达，病毒感染动物之后才会在动物体内表达P80蛋白。自然感染和弱毒活疫苗免疫后的动物中都可以产生针对p80的抗体，因此具有重要的诊断价值，P80抗原和P80抗体也成为目前BVD诊断检测的靶标。传统的诊断检测BVD的方法有分子生物学方法、酶联免疫试剂盒方法、胶体金检测法等，其中分子生物学方法以聚合酶链式反应（PCR）为代表，通过检测病毒分子来确认动物是否被感染，其操作繁琐，试剂和设备昂贵，对于牛场来说难以操作；酶联免疫法利用96孔酶标板为载体，以抗原抗体特异性反应为原理检测动物是否感染BVD病毒或者产生BVD病毒抗体，具有灵敏度高、特异性好等特点，美中不足的是操作过程较为繁琐，加样精准度要求高，且需要酶标仪、恒温箱等实验设备来确保反应环境，基层养殖场、特别是现场检测时难以开展；传统的卡壳式胶体金检测试纸卡，同样利用抗原抗体反应原理，检测BVD抗原或抗体，并且操作简便、反应时间短，唯一缺陷是灵敏度不够高，可能存在假阴性或者假阳性，面对BVD净化检测的要求时难以满足。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，解决基层养殖场现场检测牛病毒性腹泻的棘手难题，本专利技术提供了一种具有高灵敏度和特异性的牛病毒性腹泻病毒抗原胶体金检测试剂盒，其主要由BVDV抗原胶体金检测试纸条、包被有冻干的胶体金标记P80特异性单克隆抗体的微孔试剂、酶标板架、样本稀释液等组成。本专利技术提供的检测试剂盒无需昂贵设备，操作简便，无需特殊培训，检测灵敏度高，非常适合基层实验室、现场检测等领域广泛应用。本专利技术的另外一个目的是提供上述牛病毒性腹泻病毒抗原检测试剂盒的制备方法。该制备方法简便、所需原料简单，易于制备、可以在较短时间内制备成功，产生较大经济效益。本专利技术还提供了一种上述牛病毒性腹泻病毒检测试剂盒在检测牛血清中BVDV的应用。利用该方法检测时，养殖场无需恒温箱和酶标仪，无需专门的场地，只要有采集好的血清样本和操作台面即可完成检测。整体耗时仅为10min，省时省力。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种具有高灵敏度和特异性的牛病毒性腹泻病毒抗原检测试剂盒，其主要由BVDV抗原胶体金检测试纸条、包被有冻干的胶体金标记P80蛋白特异性单克隆抗体的微孔试剂、微孔板架、样本稀释液等组成。其中，所述的BVDV抗原胶体金检测试纸条（图2和图3）由PVC背板（1）、硝酸纤维素膜（NC膜）（2）、样品垫（5）、吸水垫（6）构成。进一步地，其中硝酸纤维素膜（2）为整个检测反应的载体，粘贴在PVC背板（1）上，其上喷涂有包被有捕获抗体的检测线（T线）（3）和包被有鼠抗牛抗抗体的质控线（C线）（4）的，其T线端粘贴有样品垫（5），样品垫的上端与T线的距离为4~10mm，并与NC膜重合约1~3mm；其C线端粘贴有吸水垫（6），吸水垫与C线的距离为4~10mm，并与NC膜重合约1~3mm。检测样本时，样品垫部分浸入稀释的血清样本，确保样本能在虹吸作用下沿胶体金试纸条由样品垫向吸水垫方向（图2箭头方向）爬行。所述的包被有捕获抗体的检测线（T线）（3），其捕获抗体可为P80蛋白特异性单克隆抗体、P80蛋白多克隆抗体、牛病毒性腹泻病毒多克隆抗体、牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体等，其中优选抗体为P80蛋白特异性单克隆抗体，是由如SEQIDNo.1所列基因序列表达的蛋白质免疫小鼠制备筛选的；所述的包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（C线）（4），在包被时还可加入染料，标记出C线位置，以方便客户检测时识别试纸条的方向；所述的样品垫（5）为玻璃纤维或纤维素或者纺织聚合物，其经过缓冲液浸泡后晾干，所述缓冲液为含有5%蔗糖、3%甲醇、0.5%吐温-20的0.01M磷酸盐缓冲液（pH7.2）；所述的吸水垫（6）为玻璃纤维。所述包被有冻干的P80特异性单克隆抗体（7）的微孔试剂（图4）是将胶体金颗粒标记的P80特异性单克隆抗体稀释至一定浓度，冷冻干燥在酶标微孔（8）中，然后用酶标板孔盖（9）密封。所述微孔板架为普通96孔酶标板板架。本专利技术还提供牛病毒性腹泻病毒P80抗原胶体金检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：1.P80蛋白特异性单克隆抗体的制备：(1)BVDV病毒P80基因的合成：根据Genbank公布的牛病毒性腹泻病毒P80基因序列（登录号A22708.1），并依据其优势表位，进行串联后进行基因合成（基因序列如SEQIDNO.1所列），并插入pUC载体（命名为pUC-P80），由上海生物工程有限公司完成。(2)基因克隆及载体构建：根据SEQIDNo.1所列基因序列设计引物，分别在上下游引物的近5’端添加XhoI和KpnI酶切位点，其中上游引物为：ccgctcgagggactggaaaccggatg；下游引物为：ggggtaccctctagtctttgatcttctatg。以pUC-P80基因为模板扩增目标片段，双酶切后，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。然后与表达载体pFastBacHT-B连接得到重组表达载体pFastBacHT-P80，构建成功后测序鉴定。(3)重组基因工程菌构建、诱导表达及纯化：将阳性重组质粒pFastBacHT-P80转座DH10Bac感受态细胞，通过用KTG抗生素和蓝白斑筛选阳性克隆，提取Bacmid，转染SF9昆虫细胞，观察转染后的细胞病变并收集重组杆状病毒。将重组杆状病毒以MOI0.1感染SF9昆虫细胞，4d后5000r/min离心10min收集上清。目的蛋白的纯化参照Ni-NTA纯化系统说明书进行。(4)免疫动物及抗体筛选采用市售的BVDV灭活疫苗或重组P80蛋白抗原免疫小鼠，采集血清本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牛病毒性腹泻病毒P80抗原胶体金检测试剂盒，主要由P80抗原胶体金检测试纸条和包被有冻干的胶体金标记P80特异性单克隆抗体的微孔试剂组成，其中：所述P80抗原胶体金检测试纸条由PVC背板、吸水垫、样品垫、喷涂有包被有捕获抗体的检测线（T线）和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（C线）的硝酸纤维素膜（NC膜）构成；其中硝酸纤维素膜为整个检测反应的载体，粘贴在PVC背板上，其C线端粘贴有吸水垫，吸水垫与C线的距离为4~10mm，并与NC膜重合约1~3mm，T线端粘贴有样品垫，样品垫的上端与T线的距离为4~10mm，并与NC膜重合约1~3mm；所述包被有冻干的胶体金标记P80特异性单克隆抗体的微孔试剂中包被的抗体是有如SEQ ID No.1所列基因序列表达的蛋白免疫小鼠制备获得。

【技术特征摘要】
1.一种牛病毒性腹泻病毒P80抗原胶体金检测试剂盒，主要由P80抗原胶体金检测试纸条和包被有冻干的胶体金标记P80特异性单克隆抗体的微孔试剂组成，其中：所述P80抗原胶体金检测试纸条由PVC背板、吸水垫、样品垫、喷涂有包被有捕获抗体的检测线（T线）和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（C线）的硝酸纤维素膜（NC膜）构成；其中硝酸纤维素膜为整个检测反应的载体，粘贴在PVC背板上，其C线端粘贴有吸水垫，吸水垫与C线的距离为4~10mm，并与NC膜重合约1~3mm，T线端粘贴有样品垫，样品垫的上端与T线的距离为4~10mm，并与NC膜重合约1~3mm；所述包被有冻干的胶体金标记P80特异性单克隆抗体的微孔试剂中包被的抗体是有如SEQIDNo.1所列基因序列表达的蛋白免疫小鼠制备获得。2.根据权利要求1所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述的包被有捕获抗体的检测线（T线）（3），其捕获抗体可为P80蛋白特异性单克隆抗体、P80蛋白多克隆抗体、牛病毒性腹泻病毒多克隆抗体、牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体，其中优选为如SEQIDNo.1所列基因序列表达蛋白免疫小鼠制备获得的单克隆抗体。3.根据权利要求1所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述的样品垫为玻璃纤维或纤维素或者纺织...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨春江，赵荣茂，于在江，莫勋，郭秀锋，宋辉，吴佳兴，魏佳玥，宋世燕，
申请(专利权)人：北京纳百生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11