牛传染性鼻气管炎病毒抗体检测试剂盒及其应用制造技术

提供了一种牛传染性鼻气管炎病毒抗体检测试剂盒，所述检测试剂盒由重组gD抗原包被酶标板、阴性对照、阳性对照、辣根过氧化物酶标记的IBR特异性单克隆抗体、样本稀释液、洗涤液、底物液和终止液组成。利用该试剂盒，可在较短时间内检测出牛群是否感染牛传染性鼻气管炎，并制定相应的管理策略。针对当前动物疫病防控的复杂形势，具有非常广阔的市场前景，可在基层检测和政府监管中发挥重大作用。

【技术实现步骤摘要】
牛传染性鼻气管炎病毒抗体检测试剂盒及其应用
本专利技术属于动物疫病快速检测
，涉及一种牛传染性鼻气管炎病毒抗体检测试剂盒及其应用。
技术介绍
牛传染性鼻气管炎（infectiousbovinerhinotracheitis，简称IBR）是由牛疱疹病毒1型（BHV—1）感染家养牛和野生牛引起的一种病毒性传染病，被世界动物卫生组织列为B类疾病，我国农业部列为二类动物疫病。该病广泛分布于世界各地，死亡率较低。许多感染牛呈亚临床症状经过，往往由于细菌继发感染导致更为严重的呼吸道疾病及混合感染，因此对于IBR的早期感染诊断检测非常重要。农业部行业标准《NY/T575-2002牛传染性鼻气管炎诊断技术》列出了3种IBR的检测方法：病毒分离鉴定、微量血清中和试验、酶联免疫检测方法，前两种方法操作繁琐复杂，耗时长，所需试剂及设备较多，在基层牧场很难展开；而酶联免疫法整体耗时接近4h，并且需要配制各种溶液及准备组分，对于基层兽医实验室而言，亦难以开展。更进一步而言，标准中所描述的酶联免疫法为兔多克隆抗体间接酶联免疫法，采用病毒抗原包被酶标板，存在一定的散毒风险，实验废物如处理不当亦可能导致交叉污染。如果开发出方便快捷、无散毒风险、省时省力的牛传染性鼻气管炎检测试剂盒则能极大程度地改善当前IBR的检测现状。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种牛传染性鼻气管炎病毒抗体检测试剂盒，利用该检测试剂盒可在1小时内检测出牛群是否感牛传染性鼻气管炎病毒。本专利技术提供的检测试剂盒无需昂贵设备，操作简便，无需特殊培训，检测灵敏度高，非常适合基层兽医实验室、养殖场检测应用。本专利技术所提供的牛传染性鼻气管炎病毒抗体检测试剂盒基于酶联免疫阻断法检测原理，由重组gD抗原包被酶标板、阴性对照、阳性对照、辣根过氧化物酶标记的IBR特异性单克隆抗体、样本稀释液、洗涤液、底物液和终止液组成。其中，所述重组gD抗原包被酶标板上包被的是重组牛传染性鼻气管炎gD蛋白，所述重组gD蛋白是利用如SEQIDNo.1所列的截短型gD序列在大肠杆菌系统中表达获得的，表达该蛋白的基因序列如SEQIDNo.2所列。所述阴性对照为进口胎牛血清，并经《NY/T575-2002牛传染性鼻气管炎诊断技术》中所列方法确认为阴性。所述阳性对照为标准牛传染性鼻气管炎抗体阳性牛血清。所述辣根过氧化物酶标记的IBR特异性单克隆抗体是利用辣根过氧化物酶标记IBR特异性鼠单抗制备的，其中IBR特异性鼠单抗是利用重组gD蛋白免疫小鼠后筛选获得的，其针对牛传染性鼻气管炎病毒具有特异性反应。所述的样本稀释液是pH7.2的0.02mol/LPBS。所述的洗涤液是含有0.05%吐温-20的0.01mol/LPBS（pH7.2）。所述的底物液是从市场上采购的商品化单组份TMB显色底物液。所述的终止液是2mol/L硫酸溶液。本专利技术的另外一个目的是提供上述检测试剂盒的制备方法，具体包括如下步骤：（1）重组gD蛋白的制备；（2）gD蛋白特异性单克隆抗体的制备；（3）检测试剂盒各组分的制备；（4）检测试剂盒的组装。此外，本专利技术还涉及一种使用本专利技术的牛传染性鼻气管炎病毒抗体检测试剂盒检测牛血清中牛传染性鼻气管炎病毒抗体的检测方法，包括如下步骤：第一步，采集并分离血清样本。第二步，使用样本稀释液按照1:40的比例稀释样本后备用。若不立即使用，短时间内（1~4小时）应置于4℃保存，长时间（≥4小时）需置于-20℃保存。第三步，利用本专利技术的牛传染性鼻气管炎病毒抗体检测试剂盒检测处理好的样本，并最终判定结果。与传统的病原学分析方法和常规ELISA方法相比，本专利技术具有以下有益效果：1）操作简单，无需特殊仪器设备。从试剂、仪器设备来看，本方法无需有机试剂，检测样本经稀释后可以直接检测，降低了操作难度，非常适合于基层检测实验室推广应用。2）耗时短，检测效率高。整体检测时间较短，比农业部标准推荐方法省时省力。3）检测无需涉及外来病毒，无散毒风险，有利于牛场和基层兽医实验室的疫病防控及交叉污染控制。4）检测灵敏，准确率高。利用阻断法原理可以有效监测病毒抗体变化，区别于一般的间接ELISA。本专利技术提供的牛传染性鼻气管炎病毒抗体检测试剂盒与传统技术及标准方法相比较，优势明显，技术改进明显，特别是针对当前牛传染性鼻气管炎防控形式复杂的现状，具有非常广阔的市场前景，可在基层检测和政府监管中发挥重大作用。附图说明图1为gD基因的PCR扩增图。图2为gD重组蛋白的纯化鉴定图。具体实施方式下面结合具体实施方式来进一步描述本专利技术。本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚，但这些实施例仅是范例性质，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下，可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或者替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围。下述试剂、实验材料，如没有特殊说明，均来源于商品化产品。实施例1：重组gD蛋白的制备(1)重组gD抗原的制备与纯化根据GenbankNC001847中的牛传染性鼻气管炎病毒基因信息，利用DNAStar对gD蛋白的氨基酸序列的信号肽、抗原性、亲水性等进行分析，去除信号肽序列，筛选抗原性区域，最终截取2段蛋白序列，进行串联组合，合成gD基因序列，为SEQIDNo.2序列，并设计一对引物，上游引物序列为SEQIDNo.3序列，下游序列为SEQIDNo.4序列。以合成基因为模板，进行PCR反应。PCR反应体系为50μL。在灭菌0.2mLEP管中分别加入以下试剂：模板DNA0.5μL，10XExTaqTNBuffer（Mg2+free）5μL，dNTPMixture(各2.5mM)2μL，MgCl2（25mM）4μL，上游引物（20pM/μL）0.5μL，下游引物（20pM/μL）0.5μL，TaKaRaExTaqTM(5u/μL)0.25μL，灭菌超纯水37.25μL。PCR反应完成后，将PCR产物与10x溴酚蓝上样缓冲液混匀，经1.5%琼脂糖凝胶电泳（含EB0.5μg/mL）。结束电泳，在紫外灯下观察，用凝胶成像系统拍照并分析。如图1所示。使用商品化回收试剂盒（天根生化）回收纯化产物，经双酶切后的gD基因片段与质粒载体pET-32a(+)以3:1的比例混合，同T4DNA连接酶在16℃条件下进行粘性末端定向连接，然后转化入BL21(DE3)感受态细胞，然后筛选阳性菌落送上海杰瑞进行测序鉴定，并将测序结果与Genbank数据库中做Blast对比分析，确保序列正确。gD重组蛋白表达基因工程菌接种于含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，180r/min下摇床振荡培养至对数生长期中期（OD600nm为0.6~0.8），加入IPTG至终浓度为1.0mM，继续诱导培养1~5小时，用pH7.2的PBS洗涤1次，将菌体悬液用溶菌酶和超声裂解，4℃下12000r/min离心20min，将可溶蛋白和包涵体分开。分别取裂解上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，分析重组蛋白的可溶性。用His-Tag亲和层析柱（Merck产品）分离纯化重组gD蛋白，-20℃以下保存备用。gD纯化蛋白如图2所示。(2)重组gD蛋白的特异性检测将纯化的重组gD蛋白经SDS-PAGE电泳转印至NC膜，进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牛传染性鼻气管炎病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒由重组gD抗原包被酶标板、阴性对照、阳性对照、辣根过氧化物酶标记的IBR特异性单克隆抗体、样本稀释液、洗涤液、底物液和终止液组成，其中：所述重组gD抗原包被酶标板上包被的是重组牛传染性鼻气管炎gD蛋白；所述阴性对照为进口胎牛血清，并经《NY/T 575‑2002 牛传染性鼻气管炎诊断技术》中所列方法确认为阴性；所述阳性对照为标准牛传染性鼻气管炎抗体阳性牛血清；所述辣根过氧化物酶标记的IBR特异性单克隆抗体是利用辣根过氧化物酶标记IBR特异性鼠单抗制备的，其中IBR特异性鼠单抗是利用重组gD蛋白免疫小鼠后筛选获得的，其针对牛传染性鼻气管炎病毒具有特异性反应；所述的样本稀释液是pH7.2的0.02mol/L PBS；所述的洗涤液是含有0.05%吐温‑20的0.01mol/L PBS（pH7.2）；所述的底物液是从市场上采购的商品化单组份TMB显色底物液；所述的终止液是2mol/L硫酸溶液。

【技术特征摘要】
1.一种牛传染性鼻气管炎病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒由重组gD抗原包被酶标板、阴性对照、阳性对照、辣根过氧化物酶标记的IBR特异性单克隆抗体、样本稀释液、洗涤液、底物液和终止液组成，其中：所述重组gD抗原包被酶标板上包被的是重组牛传染性鼻气管炎gD蛋白；所述阴性对照为进口胎牛血清，并经《NY/T575-2002牛传染性鼻气管炎诊断技术》中所列方法确认为阴性；所述阳性对照为标准牛传染性鼻气管炎抗体阳性牛血清；所述辣根过氧化物酶标记的IBR特异性单克隆抗体是利用辣根过氧化物酶标记IBR特异性鼠单抗制备的，其中IBR特异性鼠单抗是利用重组gD蛋白免疫小鼠后筛选获得的，其针对牛传染性鼻气管炎病毒具有特异性反应；所述的样本稀释液是pH7.2的0.02mol/LPBS；所述的洗涤液是含有0.05%吐温-20的0.01mol/LPBS（pH7.2）；所述的底物液是从市场上采购的商品化单组份TMB显色底物液；所述的终止液是2mol/L硫酸溶液。2.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨春江，于在江，赵荣茂，曹倩倩，李月，莫勋，孙海霞，王军，陈曼利，
申请(专利权)人：北京纳百生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11