一种哺乳动物胚胎性别鉴定方法技术

本发明专利技术涉及性别鉴定技术领域，特别涉及一种哺乳动物胚胎性别鉴定方法，本发明专利技术通过在Y染色体上插入荧光报道基因，通过荧光报道基因的荧光表达，准确鉴定出哺乳动物的胚胎性别，该方法简单、高效、准确、损伤小；在构建Y染色体含荧光报道基因的雄性哺乳动物模型的过程中，选择位于Ddx3y和Uty基因的间隔区为打靶区进行外源基因的整合，降低基因打靶位点的选择对转基因动物自身的影响；在基因编辑过程中采用Cas9蛋白和根据打靶区基因序列设计的单导向sgRNA，能准确的对靶位点DNA进行切割，定向的在Y染色体的Ddx3y和Uty基因之间插入荧光报道基因，使得基因敲入手段高效、简单。

【技术实现步骤摘要】
一种哺乳动物胚胎性别鉴定方法
本专利技术涉及性别鉴定
，特别涉及一种哺乳动物胚胎性别鉴定方法。
技术介绍
性别控制技术是通过对动物的正常生殖过程进行人为干预，从而使成年雌性动物生产出人们期望性别后代的一门生物技术。这一技术对于提高畜牧生产中限性性状生产效益，避免伴性遗传病的发生，加快育种进程等方面都有重要的意义。Y染色体上性别决定序列的发现是哺乳动物性别决定理论的重要突破，对性别控制技术的发展意义重大。目前性别控制的方法主要集中在两个方面，一个是精子水平，另一个是胚胎水平。分离X、Y精子和鉴定早期胚胎的性别是目前控制后代性别比例最有效的两种方法。X、Y精子头部DNA含量的差异使通过流式细胞术分离X、Y精子成为可能，通过流式细胞术分选X、Y精子，然后根据需要用收集的X或Y精子和卵子进行受精，利用该方法进行性别控制的研究已经在兔子、猪、牛、羊、水牛等多种动物上获得了成功。但目前存在的主要问题还是分离成本高，很难在农业生产上广泛应用。其他分离X、Y精子的方法包括电泳、密度梯度离心和免疫学等，都未能取得满意的结果，而且重复性差，无法在生产上运用。目前，哺乳动物附植前胚胎性别鉴定最有效的方法主要是胚胎核型分析和PCR法，但这两种方法都需要从胚胎中取出部分细胞，因此会对胚胎的后续发育造成一定程度的损伤。另外，胚胎核型分析操作程序复杂，周期长，也限制了这一方法的推广应用。而PCR的方法虽然灵敏性很高，但也容易污染，易出现假阳性，在应用推广中也有一定的局限性。虽然性别控制技术已经取得了一定的成就和发展，但当前这些方法的局限性限制了其在畜牧生产中的推广和使用。因此，开发一种更简单高效的性别控制方法对于农业生产的发展至关重要。
技术实现思路
鉴于上述内容，有必要提供一种更简单高效的性别控制方法，该方法能精确的对哺乳动物胚胎进行性别鉴定，同时还降低了PCR假阳性的发生率，使胚胎鉴定结果达到100％的准确率。为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种哺乳动物胚胎性别鉴定方法，所述方法为：构建Y染色体含荧光报道基因的雄性哺乳动物模型；雄性哺乳动物与雌性哺乳动物进行交配后，通过观察荧光基因在胚胎中的表达鉴定动物胚胎性别为雄性或雌性。进一步的，所述雄性哺乳动物模型的构建方法为：在Y染色体两相邻的基因间选择打靶区，并确定打靶序列，根据打靶序列构建含荧光报道基因的donor载体；然后在sgRNA和Cas9mRNA的共同作用下，Y染色体基因组被剪切，然后通过DNA存在修复模板的情况下通过同源重组进行修复的功能，将荧光报道基因定点插入Y染色体中。进一步的，所述打靶区位于Ddx3y基因和Uty基因之间。进一步的，所述打靶序列为5’-AGACTAGAGAGGCTCAATTCTGG-3’。进一步的，所述含荧光报道基因的donor载体的序列为SEQIDNO：2。进一步的，所述sgRNA的体外转录模板的获得方式为：以质粒px330为模板，合成引物序列并采用PCR扩增双链DNA，为体外转录sgRNA提供模板，所述引物序列的上游引物序列为：sgRNA-IVT-F：5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGACTAGAGAGGCTCAATTCGTTTTAGAGCTAGAAATAG-3’；下游引物序列为：sgRNA-IVT-R：5’-AAAAGCACCGACTCGGTGCC-3’。其中，sgRNA的体外转录模板扩增的PCR反应体系为：补水至总体积50μL。PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，60℃退火20s，72℃延伸30s，35个循环；随后72℃终延伸5min。PCR结束后使用天根UniversalDNA纯化回收试剂盒(货号：DP214)纯化PCR产物。.进一步的，所述Cas9mRNA的体外转录模板的获取方式为：以质粒px260为模板，合成引物序列并采用PCR扩增双链DNA，为体外转录Cas9提供模板，所述引物序列的上游引物序列为：CAS9IVTF：5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGATTTCAGGTTGGACCGGTG-3’：下游引物序列为：CAS9IVTR：5’-GACGTCAGCGTTCGAATTGC-3’。其中，Cas9mRNA的体外转录模板的PCR反应体系为：补水至总体积50μL。PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸30s，35个循环；随后72℃延伸5min。PCR产物纯化方式与sgRNA相同。PCR结束后使用天根UniversalDNA纯化回收试剂盒(货号：DP214)纯化PCR产物。.进一步的，本申请所述哺乳动物为小鼠。本专利技术具有如下有益效果：1、本专利技术通过在Y染色体上插入荧光报道基因，通过荧光报道基因的荧光表达，准确鉴定出哺乳动物的胚胎性别，该方法简单、高效、准确、损伤小；在构建Y染色体含荧光报道基因的雄性哺乳动物模型的过程中，选择位于Ddx3y和Uty基因的间隔区为打靶区进行外源基因的整合，降低基因打靶位点的选择对转基因动物自身的影响；在基因编辑过程中采用Cas9蛋白和根据打靶区基因序列设计的单导向sgRNA，能准确的对靶位点DNA进行切割，形成双链断裂缺口(DSB)；同时，在此位置引入构建好的含有荧光报道基因的donor质粒，利用细胞能通过同源重组(HR)的途径进行修复的特性，定向的在Y染色体的Ddx3y和Uty基因之间插入荧光报道基因，使得基因敲入手段高效、简单。【附图说明】图1是本专利技术实施例中EGFP基因定点整合模式图。图2是本专利技术实施例的Y-EGFP转基因小鼠图；其中，右边为雌性小鼠；左边为雄性小鼠；图3是转基因小鼠5’和3’端整合位点鉴定图；其中，M为DL2000plus，条带从上到下依次为2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。图4是脱靶位点测序图；图5是Y-GFP小鼠与野生雌鼠交配后取得的早期胚胎的荧光图；图6是绿色荧光胚胎和非绿色荧光胚胎PCR法性别鉴定图。其中，DL1000为Marker，条带从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp。【具体实施方式】为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术。但是本专利技术能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似改进，因此本专利技术不受下面公开的具体实施的限制。1、基因打靶位点的选择：选择Ddx3y和Uty基因之间的间隔序列作为打靶区域，进行外源基因的整合；在打靶区域找到靶序列：5’-AGACTAGAGAGGCTCAATTCTGG-3’(SEQIDNO：1)，然后在数据库中进行靶点序列的比对，避免脱靶。2、模板质粒(donor质粒)的构建将上述靶位点定为切割位点，分别通过PCR扩增切割位点两端的同源臂序列以含EGFP的质粒为模板扩增含EGFP的DNA序列，经过酶切后和两端同源臂序列连接，亚克隆成donor质粒，其质粒序列为SEQIDNO：2。3、体外转录和纯化Cas9mRNA和sgRNA(1)体外转录和纯化s本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种哺乳动物胚胎性别鉴定方法，其特征在于，所述方法为：构建Y染色体含荧光报道基因的雄性哺乳动物模型；雄性哺乳动物与雌性哺乳动物进行交配后，通过观察荧光基因在胚胎中的表达鉴定动物胚胎性别为雄性或雌性。

【技术特征摘要】
1.一种哺乳动物胚胎性别鉴定方法，其特征在于，所述方法为：构建Y染色体含荧光报道基因的雄性哺乳动物模型；雄性哺乳动物与雌性哺乳动物进行交配后，通过观察荧光基因在胚胎中的表达鉴定动物胚胎性别为雄性或雌性。2.根据权利要求1所述的一种哺乳动物胚胎性别鉴定方法，其特征在于，所述雄性哺乳动物模型的构建方法为：在Y染色体两相邻的基因间选择打靶区，并确定打靶序列，根据打靶序列构建含荧光报道基因的donor载体；然后在sgRNA和Cas9mRNA的共同作用下，Y染色体基因组被剪切，然后通过DNA存在修复模板的情况下通过同源重组进行修复的功能，将荧光报道基因定点插入Y染色体中。3.根据权利要求2所述的一种哺乳动物胚胎性别鉴定方法，其特征在于，所述打靶区位于Ddx3y基因和Uty基因之间。4.根据权利要求2所述的一种哺乳动物胚胎性别鉴定方法，其特征在于，所述打靶序列为5’-AGACTAGAGAGGCTCAATTCTGG-3’。5.根据权利要求2所述的一种哺乳动物胚胎性别鉴定方法，其特征在于，所述含荧光报道基因的donor载体的序列为SEQIDNO：2。6.根据权利要求2所述的一种哺乳动物胚胎性别鉴定方法，其特征在于，所述sgRNA的体外转录模板扩增方式为：...

【专利技术属性】
技术研发人员：张明，赵秀玲，左二伟，陆阳清，魏巍，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西,45