指示性别的半滑舌鳎外泌体microRNA及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种指示性别的半滑舌鳎外泌体microRNA及试剂盒，属于鱼类生物技术领域，所述microRNA性别标签为ssa‑miR‑23a‑3p，其序列为ATCACATTGCCAGGGATTTCC；以解决半滑舌鳎雄鱼及伪雄鱼在生殖遗传差异的区分问题。本标志miRNAs具有在雄鱼和伪雄鱼中显著差异表达的特点，是特异的分子识别标记。

【技术实现步骤摘要】
指示性别的半滑舌鳎外泌体microRNA及试剂盒
本专利技术属于鱼类生物
，特别是海水鱼精液外泌体标志物应用领域。
技术介绍
半滑舌鳎雌、雄鱼生长速度差异巨大，无论是自然界还是养殖环境都不同程度的存在着一种伪雄鱼。伪雄鱼的染色体是ZW型，而它的生殖器官则和雄鱼一样，也可以产生精子且繁育后代。目前识别雄鱼和伪雄鱼的方法有染色体法和性别特异的分子标记的方法。外泌体内含物miRNAs，其在进化上高度保守，性质稳定，易于定量检测，具有生物标志物的特性，对于鱼类性别鉴定的具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对半滑舌鳎雄鱼及伪雄鱼识别问题，提出一种半滑舌鳎精液来源的外泌体microRNAs作为生物标记物识别雄鱼及伪雄鱼的方法。本专利技术是采取以下技术方案实现的：半滑舌鳎精浆外泌体microRNA在性别鉴定中的应用，microRNA性别标签为ssa-miR-23a-3p，其序列为ATCACATTGCCAGGGATTTCC。本专利技术还提供一种所述microRNA性别标签的筛选方法如下：1)精浆外泌体分离鉴定后，对精浆外泌体smallRNA进行测序分析，将cleanreads依次和Rfam数据库、cDNA序列、物种重复序列库、miRBase数据库对测序结果中的smallRNA进行分类注释；将分类注释后的序列和miRBase数据库比对，进行已知microRNA的统计；使用未注释上的序列进行新的microRNA预测，microRNA差异表达分析，差异表达miRNA靶基因的通路富集分析和功能富集分析，最后与样品进行相关性匹配，筛选出一种或者多种，对两种样品具有指示作用的microRNA作为候选microRNAs生物标记物；2)将候选标签microRNAs按照以下四个标准进行过滤：(1)在两种样品中表达有极显著差异，即p值小于0.01；(2)与已知数据库进行比对确认存在的microRNAs；(3)两样品中至少有一个的TPM值大于10；(4)foldChange值大于4，所述foldChange值＝TPMSample_ZZ./TPMSample_ZW；3)提取两组验证样本：经外周血染色体鉴定后的雄鱼及伪雄鱼精浆来源外泌体总RNA，利用MicroRNA定量分析试剂盒定量检测步骤2)过滤后的microRNAs的差异表达情况，筛选出最具标签指示作用的miRNAs作为最终的标签microRNAs；根据统计学分析原理，P值小于0.05为显著差异，最终筛选到ssa-miR-23a-3p，序列为ATCACATTGCCAGGGATTTCC，此种标签在雄鱼样本中有高表达，而在伪雄鱼样本中表达量极低。依据MicroRNA定量分析结果，进行雄鱼和伪雄鱼的判定。本专利技术还提供了一种半滑舌鳎性别鉴定试剂盒，所述试剂盒包括ssa-miR-23a-3p检测引物探针，所述引物探针序列为F1：TGGTCACATCACATTGCCAG；R1：TCGTATCCAGTGCAGGGTC；逆转录引物ssa-miR-23a-3p-RT：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAGGAAATCC，以及其它逆转录试剂和qPCR荧光定量试剂。内参基因为U6，U6的引物为：U6-F：CTCGCTTCGGCAGCACATATACT；U6-R：ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC。进一步，引物探针序列的5’端标记了荧光基团，3’端标记淬灭基团，以适合Taqmanprobe-basedqRT-PCR方法检测。本专利技术与现有技术相比的有益效果：本专利技术运用精液外泌体microRNAs进行半滑舌鳎雄鱼和伪雄鱼的判定，准确率达90％以上，且鉴定结果可靠，不会对鱼体造成创伤。本专利技术同时利用该鉴别标签开发了检测的试剂盒，设计了针对该标签的扩增引物，方便快捷，简单高效。附图说明图1是本专利技术提出的标志miRNA经20个验证样本验证后的qRT-PCR表达量；图2本专利技术20个验证样本验证后在两组样本中的qRT-PCR表达量均值。具体实施方式以下结合具体实施方式对本专利技术做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本专利技术的保护范围。实施例1一种半滑舌鳎精浆外泌体miRNAs作为生物标记物的筛选确定1、精液样本的收集收集半滑舌鳎性成熟雄鱼及伪雄鱼精液各50尾，每尾取0.5ml精液于离心管中用于外泌体分离鉴定。2、外泌体的提取(1)精液样本取0.5ml转移1.5mlEP管，放置于4℃，1200g离心15min去除精子细胞，4℃，15000g离心20min去除小细胞杂质和碎片，用PBS稀释1倍后，使用0.45um滤膜进行预过滤，过滤液再经0.22um滤膜过滤。(2)样品用SBIExoQuick-TCforTissueCultureMediaandUrine试剂盒提取外泌体。(3)步骤2后离心去上清，收集溶解样并完全转移至一个无RNA酶的2ml管中。3、外泌体的鉴定：日立H600IV型透射电镜观察，透射电镜分析鉴定后，剩余样品用于RNA提取和测序分析。4、外泌体的microRNA测序分析TRizol法提取外泌体的RNA，质检后构建小RNA文库并基于illumina平台测序，完成测序后进行数据过滤分析，将cleanreads依次和Rfam数据库、cDNA序列、物种重复序列库、miRBase数据库进行比对注释。将注释后的序列和miRBase数据库比对，进行已知microRNA的统计。使用未注释上的序列进行新的microRNA预测，microRNA差异表达分析，差异表达miRNA靶基因的通路富集分析和功能富集分析，最后与雄鱼、伪雄鱼两个样品进行相关性匹配，筛选出一种或者多种，对雄鱼、伪雄鱼两种样品具有指示作用的miRNA作为候选标签microRNAs。5、将候选标签microRNAs按照以下四个标准进行过滤：(1)在两种样品中表达有极显著差异，即p值小于0.01；(2)与已知数据库进行比对确认存在的microRNAs；(3)两样品中至少有一个的TPM值大于10；(4)foldChange值大于4，所述foldChange值＝TPMSample_ZZ./TPMSample_ZW；6、提取两组验证样本：经外周血染色体鉴定后的雄鱼及伪雄鱼精浆来源外泌体总RNA，利用MicroRNA定量分析试剂盒定量检测步骤5)过滤后的microRNAs差异表达情况，选取2-ΔΔCt进行计算分析，筛选出最具标签指示作用的microRNAs作为最终的标签microRNAs；根据统计学分析原理，P值小于0.05为显著差异，最终筛选到ssa-miR-23a-3p，序列为ATCACATTGCCAGGGATTTCC，此种标签在雄鱼样本中有高表达，而在伪雄鱼样本中表达量极低。实施例2利用半滑舌鳎精浆外泌体microRNA标志物鉴定雄鱼和伪雄鱼基于精液外泌体microRNA标志物ssa-miR-23a-3p的鉴定试剂盒包括ssa-miR-23a-3p的检测引物探针；所述引物探针序列为F1：TGGTCACATCACATTGCCAG；R1：TCGTATCCAGTGCAGGGTC。引物包含逆转引物RT：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.半滑舌鳎精浆外泌体microRNA在性别鉴定中的应用，其特征在于所述microRNA性别标签为ssa‑miR‑23a‑3p，其序列为ATCACATTGCCAGGGATTTCC。

【技术特征摘要】
1.半滑舌鳎精浆外泌体microRNA在性别鉴定中的应用，其特征在于所述microRNA性别标签为ssa-miR-23a-3p，其序列为ATCACATTGCCAGGGATTTCC。2.权利要求1所述microRNA性别标签的筛选方法如下：1)精浆外泌体分离鉴定后，对精浆外泌体smallRNA进行测序分析，将cleanreads依次和Rfam数据库、cDNA序列、物种重复序列库、miRBase数据库对测序结果中的smallRNA进行分类注释；将分类注释后的序列和miRBase数据库比对，进行已知microRNA的统计；使用未注释上的序列进行新的microRNA预测，microRNA差异表达分析，差异表达miRNA靶基因的通路富集分析和功能富集分析，最后与样品进行相关性匹配，筛选出一种或者多种，对两种样品具有指示作用的microRNA作为候选microRNAs生物标记物；2)将候选标签microRNAs按照以下四个标准进行过滤：(1)在两种样品中表达有极显著差异，即p值小于0.01；(2)与已知数据库进行比对确认存在的microRNAs；(3)两样品中至少有一个的TPM值大于...

【专利技术属性】
技术研发人员：张博，贾磊，赵娜，李坤明，李仰真，刘克奉，高燕，车金远，
申请(专利权)人：天津渤海水产研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12