一种基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系，所述体系包括具有标记指示作用的8个SNPs，该8个SNPs位于同一条染色体NC_024328.1上，位置信息如下：SNP1—13754040，SNP3‑14518947，SNP4‑14546665，SNP5‑15320226，SNP6‑14238006，SNP7‑14546702，SNP9‑14802286，SNP10‑14802427。本体系只可在多种遗传分析仪器上操作，可实现自动分型并鉴定出雄鱼和伪雄鱼。相比于目前鉴定半滑舌鳎遗传性别的方法，该方法操作更快捷，检测通量更高，更重要的是，该方法具有极高的准确率。

A screening system and its application for the true and false males of tongue sole

【技术实现步骤摘要】
一种基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系和应用
本专利技术属于水产生物技术中的海水鱼类遗传性别鉴定
，尤其是一种基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系和应用。
技术介绍
半滑舌鳎是比目鱼的一种，雌性个体的生长速率是雄性个体的2-4倍，雄鱼生长缓慢、个体体型小，降低了半滑舌鳎的养殖产量，增加了养殖成本。研究表明半滑舌鳎性别决定机制为性染色体Z和W，半滑舌鳎正常雄鱼具有ZZ型的染色体，正常雌鱼具有ZW型的染色体。而伪雄鱼遗传的是雌性染色体，基因型都是ZW型。但从其体貌特征和生殖器官上均表现为雄性特征，也可以像雄鱼一样产生可育精子和繁育后代。而且如果用伪雄鱼作为父本，那么后代也会遗传父本的特征成为伪雄鱼。这样通过逐代积累，就导致了半滑舌鳎养殖群体中生理雌性的比例的失衡。半滑舌鳎真伪雄鱼甄别、剔除伪雄鱼作父本对生产养殖具有重要的应用价值。半滑舌鳎性别特异分子标记已经开发了多个。前人通过AFLP(amplifiedfragmentlengthpolymorphism，扩增片段长度多态性)标记技术分离到半滑舌鳎雌性特异AFLP标记(Chenetal.，2007)，由于AFLP标记是显性遗传，应用中不能区分ZW雌性和WW超雌个体，难以避免假阴性的结果，从而对ZZ雄鱼和ZW雌鱼产生误判。通过对半滑舌鳎共显性性别特异微卫星scaffold68-2标记筛选(刘洋等，2014)，可针对共显性性别特异标记位点设计引物对半滑舌鳎遗传性别进行鉴定，但实际应用中微卫星内INDEL短(小于50bp)，导致来自Z染色体和W染色体的两种PCR扩增产物片段长度差异较小，对在凝胶电泳判定其长短时造成不小的困难。此外以上的多种标记均为单位点标记，即针对某一特定位点的标记，而专利技术一种基于多个SNPs的共反应体系，以多位点共同作性别判定，可以极大地提高半滑舌鳎真伪雄鱼性别甄别的准确性，形成检验该鱼遗传性别的黄金标准。通过检索，发现如下一篇与本专利技术专利申请相关的专利公开文献：一种基于荧光分子标记体系的半滑舌鳎真伪雄鱼甄别方法(CN109825565A)，一种基于荧光分子标记体系的半滑舌鳎真伪雄鱼甄别方法。分子标记的设计和检测是基于五引物扩增阻碍突变体系(即PARMS)。利用对半滑舌鳎Z/W性染色体DNA序列的生物信息学分析和分子生物学方法成功寻找和确认了Z/W性染色体间DNA序列上的SNP多态性位点，并设计和验证了1组基于PARMS的荧光分子标记。通过对60条性别已知半滑舌鳎鱼样本的高通量qPCR分型实验验证表明该PARMS分子标记可成功鉴定所有样本中的真伪雄鱼。相比于目前鉴定方法和标记，该标记和相应的检测方法在保证准确率的前提下，使操作更快捷，成本更低廉，检出率更高，并可实现高通量检测。通过对比，本专利技术专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系和应用，该体系只可在多种遗传分析仪器上操作，可实现自动分型并鉴定出雄鱼和伪雄鱼。相比于目前鉴定半滑舌鳎遗传性别的方法，该方法操作更快捷，检测通量更高，更重要的是，该方法具有极高的准确率。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系，所述体系包括具有标记指示作用的8个SNPs，该8个SNPs位于同一条染色体NC_024328.1上，位置信息如下：SNP1—13754040，SNP3-14518947，SNP4-14546665，SNP5-15320226，SNP6-14238006，SNP7-14546702，SNP9-14802286，SNP10-14802427。而且，所述8个SNPs经过简化基因组测序GBS(Genotypebysequencing)测序和全基因组关联分析筛选而获得。而且，所述8个SNPs的引物的名称、序列及长度为：如上所述的基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系在半滑舌鳎真伪雄鱼甄别方面中的应用。如上所述的基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系的制备方法，步骤如下：S1、对45条半滑舌鳎雌雄鱼简化基因组测序后，利用全基因组关联分析筛选雌雄鱼差异SNPs位点；S2、在寻找到的差异显著top300中，对全基因组关联分析给出的p值划定两条显著性水平线，该p值已经进行-log10转换，一条是FDR＝0.05时的p值，一条是经过Bonferroni矫正后的p＝0.05；选择显著性水平线以上的位点进行实验验证；Bonferroni校正后的显著差异水平为6.987842，该校正后的显著差异水平的计算为：-log10(0.05/numberofSNP)；选取10-7次方筛选的差异位点共70个作为候选SNPs位点；S3、从70个位点中选取missense_variant、5_prime_UTR_variant、downstream_gene_variant、upstream_gene_variant不同类型的SNPs共10个作为标记验证和Snapshot体系开发的终选SNPs；基于上述筛选的SNPs位点位于同一条染色体NC_024328.1上，SNP1—13754040，SNP2-13471049，SNP3-14518947，SNP4-14546665，SNP5-15320226，SNP6-14238006，SNP7-14546702，SNP8-15087253，SNP9-14802286，SNP10-14802427，设计出一组可用于半滑舌鳎性别鉴定的Snapshot标记引物；S4、利用多重PCR反应体系进行分型实验，验证10标记反应体系是否可鉴定出半滑舌鳎的遗传性别；S5、将SNaPshot测序结果与已知标记检测的结果进行准确性和检出率的比对，证明该反应体系能够鉴定出半滑舌鳎的遗传性别。利用如上所述的基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系鉴别多位点半滑舌鳎真伪雄鱼的方法，步骤如下：S1：利用酚-氯仿提取法从半滑舌鳎鱼鳍组织中提取基因组DNA；S2：构建反应多重PCR反应体系：反应程序：每个样本的预扩增产物等比例混合后取4μl用于消化，ExoI酶稀释10倍后消化体系如下：预扩增产物纯化程序：37℃1.0h，75℃20min；延伸体系：延伸条件：96℃10s，50℃5s，60℃30s，×30cycles；S3：3730xl上机检测1)96孔板中每孔加入分子量内标和甲酰胺混合液9μl，内标和甲酰胺混合液的体积比为0.5：8.5，PCR产物1.0μl；2)95℃变性3min，上机检测。本专利技术取得的优点和积极效果为：1、本专利技术基于10个SNP位点的共检测体系，其中有效位点为8个，只需一个多重PCR反本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系，其特征在于：所述体系包括具有标记指示作用的8个SNPs，该8个SNPs位于同一条染色体NC_024328.1上，位置信息如下：SNP1—13754040，SNP3-14518947，SNP4-14546665，SNP5-15320226，SNP6-14238006，SNP7-14546702，SNP9-14802286，SNP10-14802427。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系，其特征在于：所述体系包括具有标记指示作用的8个SNPs，该8个SNPs位于同一条染色体NC_024328.1上，位置信息如下：SNP1—13754040，SNP3-14518947，SNP4-14546665，SNP5-15320226，SNP6-14238006，SNP7-14546702，SNP9-14802286，SNP10-14802427。


2.根据权利要求1所述的基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系，其特征在于：所述8个SNPs经过GBS测序和全基因组关联分析筛选而获得。


3.根据权利要求1或2所述的基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系，其特征在于：所述8个SNPs的引物的名称、序列为：








4.如权利要求1至3任一项所述的基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系在半滑舌鳎真伪雄鱼甄别方面中的应用。


5.如权利要求1至3任一项所述的基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系的制备方法，其特征在于：步骤如下：
S1、对45条半滑舌鳎雌雄鱼简化基因组测序后，利用全基因组关联分析筛选雌雄鱼差异SNPs位点；
S2、在寻找到的差异显著top300中，对全基因组关联分析给出的p值划定两条显著性水平线，该p值已经进行-log10转换，一条是FDR＝0.05时的p值，一条是经过Bonferroni矫正后的p＝0.05；选择显著性水平线以上的位点进行实验验证；Bonferroni校正后的显著差异水平为6.987842，该校正后的显著差异水平的计算为：-log10(0.05/numberofSNP)；选取10-7次方筛选的差异位点共70个作为候选SNPs位点；
S3、从70个位点中选取missense_varian...

【专利技术属性】
技术研发人员：张博，贾磊，赵娜，刘克奉，何晓旭，王群山，赵东康，鲍宝龙，
申请(专利权)人：天津渤海水产研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12